Licht

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 502 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie hat unsere Fähigkeit, biologische Prozesse schnell und über lange Zeiträume hinweg sichtbar zu machen und quantitativ zu messen, verändert. In diesem Aufsatz diskutieren wir aktuelle und zukünftige Entwicklungen in der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie, von denen wir erwarten, dass sie ihre Möglichkeiten weiter erweitern werden. Dazu gehören intelligente und adaptive Bildgebungsschemata zur Überwindung traditioneller Kompromisse bei der Bildgebung, z. B. räumlich-zeitliche Auflösung, Sichtfeld und Probengesundheit. Bei der intelligenten Mikroskopie entscheidet ein Mikroskop selbstständig, wo, wann, was und wie abgebildet werden soll. Wir untersuchen außerdem, wie Bildwiederherstellungstechniken Möglichkeiten zur Überwindung dieser Kompromisse bieten und wie „oben offene“ Lichtblattmikroskope eine multimodale Bildgebung mit hohem Durchsatz ermöglichen können. Daher gehen wir davon aus, dass die Lichtblattmikroskopie in Zukunft eine wichtige Rolle in der biomedizinischen und klinischen Bildgebung spielen wird.

In den letzten Jahrzehnten haben uns Mikroskope unschätzbare Erkenntnisse darüber geliefert, wie biologische Prozesse in Raum und Zeit organisiert sind. Eine Kerninnovation war die selektive Markierung von Proteinen und Lipiden mit Fluoreszenzmarkern1,2, die Fluoreszenzmikroskopietechniken wie die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie (oder kurz Lichtblattmikroskopie)3 ermöglichte. Die Lichtblattmikroskopie ermöglicht es uns, Strukturkomponenten in vivo4,5,6 und in vitro7,8,9 zu visualisieren, zu quantifizieren und dynamisch zu verfolgen. Die Grundlagen der Lichtblattmikroskopie werden in mehreren Übersichten behandelt10,11,12,13,14,15,16,17,18,19, aber kurz gesagt beruht sie auf einer orthogonalen Trennung des Beleuchtungs- und Detektionspfads, was eine selektive Messung ermöglicht Ausleuchtung einer gesamten Abbildungsebene und gleichzeitige Weitfelddetektion (Abb. 1a).

a Traditionelle Lichtblattmikroskopie wie die dreiobjektive Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM) basiert auf einer orthogonalen Anordnung von Beleuchtung (blau; Beleuchtungsobjektive IL1 und IL2) und Detektion (grün; Detektionsobjektiv DO). Dadurch wird sichergestellt, dass die axiale Auflösung der Bildgebung hauptsächlich von der Dicke des Lichtblatts (blau) bestimmt wird, was die Bildgebung großer Proben mit Weitfelderkennung (grün) und guter optischer Schnittführung ermöglicht. Um ein 3D-Volumen zu erfassen, wird die Probe entlang der Detektionsachse gescannt, indem entweder die Probe selbst bewegt wird oder indem das Lichtblatt zusammen mit dem Objektiv im Detektionspfad gescannt wird. b–d Paradebeispiele für die Bildgebung mit Lichtblättern sind die kontinuierliche Langzeitbildgebung von Entwicklungsprozessen in Maus- und Zebrafischembryonen sowie die Bildgebung von gereinigtem Gewebe mit subzellulärer Auflösung. b Katie McDole et al.4 charakterisierten die zellulären Bewegungen, die an der Mausentwicklung vom frühen Streak-Stadium (E6.5) bis zum Somite-Stadium (E8.5) beteiligt sind, indem sie einen CAGTAG1-exprimierenden Mausembryo über einen Zeitraum von über 44 Jahren mit einem Histonmarker (H2B-eGFP) abbildeten H. Maßstabsbalken: 100 μm. c Ausgewählte Projektionen aus Multi-View-Aufnahmen5 (drei Winkel) des wachsenden embryonalen Zebrafisch-Gefäßsystems, markiert mit dem fluoreszierenden Gefäßmarker (Tg(kdrl:EGFP), cyan) und dem roten Blutkörperchenmarker (Tg(GATA1a:dsRed), magenta) , abgebildet von 20 Stunden nach der Befruchtung (hpf) bis 86 hpf. Maßstabsbalken: 500 μm d Adam Glaser et al.37 führten eine großflächige Bildgebung eines erweiterten Nierenschnitts mit einer Größe von 3,2 cm × 2,1 cm und einer Dicke von 1 mm durch. Hochaufgelöste Regionen von Interesse zeigten die Morphologie von Glomeruli (Maßstabsbalken: 40 μm), Gefäßen (Maßstabsbalken: 80 μm) und Tubuli (Maßstabsbalken: 50 μm). Die erhöhte Auflösung aufgrund der Expansion wurde weiter durch eine Mehrkanalvergrößerung von DAPI-gegengefärbtem Gewebe demonstriert (Maßstabsbalken: 100 μm [oben] und 20 μm [unten]). Die Maßstabsbalken geben dabei die Abmessungen des nativen, nicht expandierten Gewebes an. Panel b wurde mit Genehmigung von Katie McDole et al. angepasst. (2018)4. Panel c angepasst von Daetwyler et al. (2019)5. Panel d angepasst von Glaser et al. (2019)37.

In diesem Aufsatz werfen wir einen Blick in die Zukunft und diskutieren mögliche zukünftige Möglichkeiten der Fluoreszenzbildgebung mit Lichtblättern. Wir werden beschreiben, wie volumetrische und zeitliche Bildbarrieren die Anwendung der optischen Mikroskopie zur Erfassung großer Proben mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung einschränken und Strategien zu deren Überwindung erforschen. Dazu gehören technologische Fortschritte, neuartige intelligente und adaptive Bildgebungsverfahren und Bildwiederherstellungstechniken. Darüber hinaus werden wir prüfen, wie solche Systeme mit flexiblen, oben offenen Lichtblattmikroskopen einhergehen, um eine multimodale Bildgebung mit hohem Durchsatz zu ermöglichen.

Die Lichtblattmikroskopie zeichnet sich durch ihre effiziente und schonende 3D-Bildgebungsfähigkeit aus. Es zeichnet sich durch eine blattförmige Lichtintensitätsverteilung aus, die die Brennebene eines Mikroskop-Detektionssystems beleuchtet (Abb. 1a)3,16. Dies bietet viele Vorteile. Am wichtigsten ist, dass nur (oder zumindest überwiegend) die Brennebene des Detektionssystems beleuchtet wird, was zu einer optischen Aufteilung und minimaler unscharfer Anregung führt15,16,19. Dies führt zu gestochen scharfen Bildern ohne Unschärfe und zu einer deutlich geringeren Probenbleiche im Vergleich zu herkömmlichen Epi-Fluoreszenz-Mikroskopietechniken wie Weitfeld oder Konfokal10,20.

Die Anregung der Brennebene wird traditionell mit einem oder zwei Beleuchtungsobjektiven erreicht, um das/die Lichtblatt(e) zu starten3,21. Dabei wird kohärentes Laserlicht in Gauß-3-, Top-Hat-21-, einzelne oder mehrere Bessel-22,23-, Airy-24- oder andere25,26-Strahlen geformt, um eine Intensitätsverteilung in der Probe zu erzeugen, die einer Schicht über eine endliche Entfernung nahekommt. Die volumetrische Bildgebung wird entweder durch Scannen der Probe3, Erhöhen der Fokustiefe27 oder Bewegen des Blatts und der Detektion28,29 erreicht.

Der Nachweis der angeregten Fluorophore erfolgt durch die Erfassung des Fluoreszenzsignals der beleuchteten Ebene mit Weitfelderkennung auf einer wissenschaftlichen Kamera16. Um den Nutzen der Lichtblattmikroskopie zu verstehen, ist das Konzept des räumlichen Arbeitszyklus wichtig. Es beschreibt, wie lange ein Fluorophor während der Dauer einer Exposition eingeschaltet ist. Da die gesamte Ebene beleuchtet wird, ist der räumliche Arbeitszyklus bei der Lichtblattmikroskopie viel höher als bei herkömmlichen konfokalen Punktscanmikroskopen, bei denen nur ein Bruchteil des Volumens auf einmal gescannt wird. Folglich können geringere Laserleistungen angewendet werden, um ein ähnliches Signal zu erzeugen. Dies ist wichtig, da viele photobleichende und phototoxische Effekte in hohem Maße nichtlinear zur Anregungsintensität sind10,20. Allerdings schränkt die Weitfelddetektion die optische Eindringtiefe von Lichtblattmikroskopen ein, da die Streuung die Bildgebung tiefer im Gewebe behindert. Dennoch kann bei kleinen Organoiden und Modellorganismen die Lichtblattmikroskopie angewendet werden, insbesondere in Kombination mit der Bildfusion30, die Informationen aus verschiedenen Ausrichtungen der Probe kombiniert. Dadurch können Bereiche, die sonst durch Streuung verdeckt würden, aus ihrem günstigsten Betrachtungswinkel besucht werden15,31,32. Durch Probenrotation können mehrere Ansichten erfasst werden, oder in neueren Implementierungen stellen bis zu vier Objektive optische Pfade für den Wechsel zwischen Lichtblattbeleuchtung und Detektion bereit33,34,35.

Diese Fähigkeiten haben es Lichtblattmikroskopen ermöglicht, 3D-Daten über Hunderte bis Tausende von Stapeln pro Probe sanft zu erfassen. Die resultierenden Daten enthüllten und ermöglichten die Quantifizierung dynamischer Prozesse wie subzellulärer Signalübertragung und Morphologie23,25, Embryogenese über Tage hinweg4,5,36 (Abb. 1b, c) und ermöglichten eine schnelle Erfassung großer, gereinigter Gewebe mit subzellulärer Auflösung37,38,39 ,40 (Abb. 1d).

Trotz der schnellen und sanften volumetrischen Bildgebung durch Lichtblatt- und andere Fluoreszenzmikroskope16 sind sie letztendlich durch volumetrische und zeitliche Bildbarrieren eingeschränkt (Abb. 2). Während sich Ersteres auf unsere Unfähigkeit bezieht, große Proben mit hoher Auflösung abzubilden, bezieht sich Letzteres auf unsere Unfähigkeit, sehr schnelle Prozesse kontinuierlich über längere Zeiträume abzubilden.

a Aktuelle Bildgebungstechniken wie Lichtblatt-, Konfokal- und Superauflösungsmikroskopie sind aufgrund technischer und praktischer Einschränkungen in ihrem abbildbaren Volumen begrenzt (blauer Farbverlauf: von niedriger bis hoher räumlicher Auflösung; weiße gestrichelte Kreise zeigen die vorherrschenden Anwendungsbereiche von an die drei Mikroskopietechniken). Um diese volumetrische Bildbarriere zu überwinden, ermöglicht die Expansionsmikroskopie Bildgebungstechniken mit niedrigerer Auflösung, die eine effektiv höhere Auflösung ermöglichen. Darüber hinaus erwarten wir, dass neuartige adaptive, intelligente Bildgebungstechniken und die Bildgebung mit mehreren Auflösungen die Barriere der volumetrischen Bildgebung überwinden werden, indem Teile eines großen Volumens selektiv mit hoher Auflösung abgebildet werden. Darüber hinaus werden Bildrekonstruktionsalgorithmen wie Compressed-Sensing- und Deep-Learning-Ansätze Möglichkeiten bieten, hochauflösende Bilder aus teilweise abgetasteten, großen Volumina zu erhalten. b Darüber hinaus erwarten wir, dass adaptive und intelligente Bildgebungsschemata die zeitliche Bildbarriere für schnelle Bilder überwinden werden Prozesse selektiv über lange Zeiträume hinweg.

Die volumetrische Bildgebungsbarriere (Abb. 2a) ergibt sich aus der maximalen volumetrischen Reichweite einer bestimmten Bildgebungstechnologie. Beispielsweise können große Präparate, etwa eine ganze Maus, derzeit nicht vollständig mit konfokaler oder hochauflösender Bildgebung abgebildet werden. Dies wird zum Teil durch physikalische Einschränkungen bestimmt, wie etwa die optische Durchdringung aufgrund von Lichtstreuung, und durch optische Technik, z. B. einen Kompromiss zwischen numerischer Apertur und Arbeitsabstand sowie Sichtfeld41.

Darüber hinaus kann eine ordnungsgemäße Nyquist-Abtastung die Geschwindigkeit begrenzen, sodass die Abbildung einer großen Probe mit hoher Auflösung unpraktisch ist. Um dies zu veranschaulichen: Eine übliche Voxel-Verweilzeit für ein herkömmliches konfokales Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Auflösung von 250 nm beträgt ~1 μs42, und somit würde es ~4,2 s dauern, ein konfokales Bild mit 2048 × 2048 × 1 aufzunehmen. Eine Verdoppelung der Auflösung mit einem Airyscan-Mikroskop auf 120 nm43 würde für das gleiche Sichtfeld ~16,8 s erfordern. Die Abbildung eines Drosophila-Eies44 mit einer Größe von 9 × 10−3 mm3 (0,18 mm Breite, 0,51 mm Länge) unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops mit Nyquist-Probenahme würde daher 76 Minuten bzw. über 10 Stunden mit einem Airyscan-Konfokalmikroskop dauern. Dadurch wird eine Bildgebung mit Geschwindigkeiten verhindert, die Untersuchungen der Zelldynamik ermöglichen, beispielsweise von Endozytoseprozessen, die innerhalb einer Minute ablaufen45. Während die Lichtblattmikroskopie aufgrund ihrer Weitfelderfassung und des hohen Arbeitszyklus viel schneller ist, können hochauflösende Versionen davon wie die Gitterlichtblattmikroskopie23,46 oder die axial geschwenkte Lichtblattmikroskopie (ASLM)47 immer noch Schwierigkeiten haben, große Volumina zu erfassen ausreichend schnell.

Ebenso besteht eine zeitliche Bildbarriere (Abb. 2b). Aufgrund der Menge der generierten Daten und der Auswirkungen auf die Probengesundheit und das Ausbleichen der Fluorophore können wir derzeit keine schnellen Prozesse über lange Zeiträume abbilden. Wenn beispielsweise über einen Tag hinweg alle 1 ms ein Bild mit 2048 × 2048 × 1 Voxeln aufgenommen wird, ergibt sich ein Datensatz von fast 700 TB. Während Datenprobleme in Zukunft möglicherweise durch neue Hardware und größere Speicher gelöst werden könnten, führt die kontinuierliche Bildgebung zu fototoxischen Effekten, die sich über die Bildgebungszyklen hinweg anhäufen20,48.

Folglich sind herkömmliche Akquisitionen, die durch Nyquist-Probenahme gesteuert werden, durch Kompromisse zwischen Probengesundheit, zeitlicher Auflösung, räumlicher Auflösung und Sichtfeld bzw. volumetrischer Abdeckung begrenzt (Abb. 3a). Um diese Kompromisse zu berücksichtigen, muss ein Mikroskopiker eine Bildgebungsmodalität auswählen, die am besten zur vorliegenden biologischen Frage passt, und ein Experiment mit den gewählten Einstellungen bis zum Ende durchführen (Abb. 3b).

a Traditionell wird eine Aufnahme durch ein begrenztes Photonenbudget der Probe bestimmt. Daher wirkt sich eine verbesserte räumliche und zeitliche Auflösung typischerweise negativ auf die Gesundheit der Probe und das abgebildete Sichtfeld aus. Die Optimierung einer Ecke der Pyramide führt somit zu Kompromissen in Richtung anderer Ecken. b Folglich werden bei einer herkömmlichen Aufnahme ein Mikroskop und/oder eine Mikroskopeinstellung so ausgewählt, dass sie die Bildgebungsanforderungen, die durch die gestellten biologischen Fragen definiert werden, am besten widerspiegeln: beste Probengesundheit, z. B. durch nicht fluoreszierende Aufnahmen (Hellfeld-Bildgebung), höchste räumliche Auflösung , z. B. zur Untersuchung molekularer Signale (blauer Baustein), größtes Sichtfeld, um z. B. einen ganzen Organismus oder ein ganzes Organ wie das gesamte Gehirn zu erfassen (oranger Baustein), oder höchste zeitliche Auflösung, um schnelle Prozesse wie neuronale Signale oder Bewegungen von Organismen zu erfassen (gelber Baustein). c Wir gehen davon aus, dass neue intelligente und adaptive Bildgebungsverfahren die derzeitigen Einschränkungen überwinden werden, indem sie modulare Bildgebung innerhalb eines Experiments ermöglichen. Dadurch wird ein Mikroskop in der Lage sein, ereignisbasierte Erkennungen zu nutzen, um automatisch zwischen Bildgebungsmodi zu wechseln, die beispielsweise ein großes Sichtfeld (orangefarbener Baustein), räumliche (blauer Baustein) und zeitliche (gelbe Bausteine) Auflösung optimieren Probengesundheit (grüne Bausteine). d In einer aktuellen Implementierung eines solchen neuartigen Bildgebungsschemas nutzten Mahecic et al.96 neuronale Netze für ereignisbasierte Erkennungen. Hier wird die Architektur des verwendeten U-Net-Netzwerks angezeigt, das ein erfasstes Eingabebild aufnimmt und eine ereignisbasierte Wahrscheinlichkeitskarte zur Führung des Mikroskops ausgibt. Das U-Net besteht aus Encoder- (Downsampling-Schichten, blau), Decoder- (Upsampling-, grün) Abschnitten und Verbindungen zwischen Schichten (beige).

Um die Barriere der volumetrischen Bildgebung zu überwinden, wurden Multiphotonenanregung49,50,51, Wellenfrontformung52, Gewebereinigung53 und Expansionsmikroskopie54,55 entwickelt, um die physikalischen Einschränkungen für die Bildgebung aufgrund von Lichtstreuungs- und Absorptionsprozessen zu überwinden. Physikalische Streuung und Absorption entstehen durch gewebeeigene absorbierende Chromophore wie Blut, Melanin, Wasser oder Pigmente sowie durch klein- und großräumige Streuer in der Struktur von Zellen und Geweben56,57. Dies führt dazu, dass die optische Mikroskopie weniger in das Gewebe eindringt und die Bildgebung auf wenige zehn bis hundert Mikrometer von der Gewebeoberfläche58 beschränkt ist (d. h. eine optische mittlere freie Weglänge).

Die Multiphotonenanregung49,50,51 hat die optische Eindringtiefe in einigen Geweben auf mehr als einen mm erhöht49,59. Wichtig ist jedoch, dass die Lichtblattmikroskopie nicht so stark von der Multiphotonenanregung profitiert wie Rasterscantechniken. Dies liegt daran, dass ein Lichtblattmikroskop immer noch ein Weitfeldbild erzeugen muss, das durch die Lichtstreuung im sichtbaren Wellenlängenbereich stark eingeschränkt ist. Im Gegensatz dazu müssen Multiphotonen-Rastermikroskope kein scharfes Bild mit den zurückkehrenden Fluoreszenzphotonen erzeugen und können daher viel tiefer vordringen. Daher ist die intravitale Lichtblattmikroskopie derzeit in den meisten Geweben auf eine Tiefe von weniger als 100 Mikrometern beschränkt.

Als Alternative hat eine kluge Auswahl eines einigermaßen durchscheinenden Modellorganismus, wie z. B. Zebrafischlinien ohne Pigmentierung,60 die Lichtblatt-Bildgebung in situ und in vivo ermöglicht. Darüber hinaus verringert die bessere Abstimmung des Brechungsindex des Immersionsmediums auf die Probe61,62 die Streuung und verbessert so die Eindringtiefe. Auch eine Umstellung auf Fluoreszenzsonden im nahen Infrarot-II-Fenster (900–1700 nm) hat sich als vielversprechend erwiesen, um die Reichweite von Lichtblattmikroskopen in Geweben zu erhöhen63. Längere Wellenlängen haben von Natur aus eine längere mittlere freie Streuweglänge und können sich mit dem Absorptionsfenster biologischer Gewebe überlappen64. Die Entwicklung von Sonden für dieses optische Fenster blieb jedoch eine Herausforderung, da das Absorbieren und Emittieren bei längeren Wellenlängen eine erhöhte elektronische Konjugation erfordert, die oft mit einer verringerten molekularen Starrheit, mehr Quellen für strahlungslosen Zerfall und niedrigen Quantenausbeuten einhergeht65,66. Quantenpunkte67 und Kohlenstoffnanoröhren68 wurden als Alternative zu fluoreszierenden Proteinen/Farbstoffmolekülen verwendet, erschweren jedoch die Markierungsspezifität und Biokompatibilität. Daher hängt die Zukunft der Lichtblattbildgebung im nahen Infrarot stark von zukünftigen Durchbrüchen in der Sondenentwicklung ab.

Darüber hinaus können Fortschritte bei Wellenfrontkorrekturverfahren, insbesondere bei der mehrfach konjugierten adaptiven Optik (MCAO)69,70, die optische Eindringtiefe weiter erhöhen. MCAO befasst sich mit dem Problem, dass herkömmliche adaptive Optik nur einen kleinen Bereich korrigieren kann, den sogenannten isoplanatischen Patch71,72. In Geweben kann dieser Bereich kleiner sein als das Sichtfeld der Kamera, wodurch die Vorteile der parallelisierten Erkennung der Lichtblattmikroskopie zunichte gemacht werden. Durch die separate Korrektur verschiedener Geweberegionen hat MCAO das Potenzial, die isoplanatische Patchgröße zu vergrößern69,70 und kann eine effektive Lichtblattbildgebung in Geweben ermöglichen. Herkömmliche adaptive Optik für die Lichtblattmikroskopie wurde demonstriert73,74, der Aufbau war jedoch sehr komplex. Um räumlich variierende Aberrationen schnell zu korrigieren, wurden spezielle Wellenfrontsensoren und verformbare Spiegel sowohl im Anregungs- als auch im Emissionspfad des Lichtblattmikroskops eingesetzt. Daher mag es zunächst weit hergeholt erscheinen, noch mehr Komponenten für MCAO hinzuzufügen, was ein solches System übermäßig komplex macht. Wir gehen jedoch davon aus, dass durch maschinelles Lernen Aberrationen erfasst werden können, ohne dass spezielle Wellenfrontsensoren75,76 erforderlich sind, was die gerätetechnischen Einschränkungen erheblich verringert. Darüber hinaus haben sich anstelle verformbarer Spiegel transmissive verformbare Wellenplatten als vielversprechend für die Wellenfrontkorrektur erwiesen77. Im Prinzip können solche Geräte in einem Bildraum des Mikroskops gestapelt werden, um MCAO durchzuführen, oder es könnte ein spezielles, integriertes 3D-Wellenfrontformungsgerät entwickelt werden.

Bei fixiertem Gewebe kann die Probenvorbereitung durch Gewebereinigung53 die mit der Lichtstreuung verbundenen Tiefenbeschränkungen weitgehend überwinden. Besonders interessant ist in diesem Zusammenhang die Expansionsmikroskopie54,55, die eine Probe physikalisch um das Zehnfache oder mehr vergrößern kann78,79 (Abb. 1d). Dies erhöht effektiv das Auflösungsvermögen jedes Mikroskops um den Erweiterungsfaktor und ermöglicht so, dass Lichtblattmikroskope Auflösungsniveaus erreichen, die bisher auf die hochauflösende Mikroskopie beschränkt waren (Abb. 2a). Daher ist die Expansionsmikroskopie eine Möglichkeit, die Hürde der volumetrischen Bildgebung durch Modifizierung der Probe zu überwinden, mit dem Vorbehalt, dass der Expansionsprozess die Ultrastruktur möglicherweise nicht immer bewahrt und eine sorgfältige Validierung erforderlich ist80. Die Herausforderung besteht nun darin, die tausendfach größeren Volumina effektiv abzubilden, was selbst die effizientesten volumetrischen Lichtblattmikroskope auf die Probe stellen wird. Mit fortschreitender Expansionsmikroskopie sehen wir einen weiteren Bedarf an der Entwicklung neuartiger Lichtblattmikroskope mit immer größerem Sichtfeld, größeren Kameras und Arbeitsabständen. Auch Techniken, die das Lichtblatt schnell kacheln81,82 oder scannen39, um ein großes Sichtfeld abzudecken, könnten bei dieser Suche wichtiger werden.

Während es möglich ist, die Bildgebungsbarrieren mit neuartigen Entwicklungen zu überwinden, wie es die Lichtblattmikroskopie3 und die Expansionsmikroskopie54,55 getan haben, besteht ein ergänzender Ansatz darin, die Stärken verschiedener Techniken modular in einem Bildgebungsworkflow zu kombinieren (Abb. 3c). Dadurch bestimmt das Mikroskopsystem selbst, wann und wie welches Modul, wie z. B. räumlich-zeitliche Abtastung, Sichtfeld und Probenbestrahlung, angewendet wird. Daher gehen wir davon aus, dass solche intelligenten und adaptiven Bildgebungsverfahren die traditionelle Nyquist-Abtastung übertreffen und die Möglichkeiten der Lichtmikroskopie, einschließlich der Lichtblattmikroskopie, erweitern werden.

Erste Schritte hin zu solchen universellen intelligenten und adaptiven Systemen wurden bereits erreicht. Eine neue Anforderung für jedes intelligente und adaptive Bildgebungssystem ist eine Rückkopplungsschleife, die auf der Echtzeitverarbeitung der erfassten Daten im laufenden Betrieb basiert, um Änderungen zu überwachen.

Zur Verbesserung der Bildgebungsparameter innerhalb einer Bildgebungsmodalität wurde die Echtzeitanalyse von Mikroskopbildern etabliert. In einer wegweisenden Arbeit verwendeten McDole et al.4 die adaptive Lichtblattmikroskopie, um die Entwicklung von Mäuseembryonen zu erfassen (Abb. 1b), indem sie Proben in Echtzeit verfolgten und das Gesamtbildvolumen und andere Mikroskopparameter automatisch anpassten. Das Bildgebungsschema kompensiert dadurch Drift, Wachstum und sich ändernde optische Eigenschaften und verbessert damit die zuvor veröffentlichte automatisierte Mikroskopieroutine AutoPilot83, die eine nahezu konstante Größe und Form erforderte. Wichtige Parameter für Lichtblatt-basierte Techniken sind die Optimierung des Abbildungsvolumens und die räumliche Überlappung zwischen Lichtblatt- und Detektionsbrennebene einschließlich ihrer relativen Versätze und Winkel4,83]. Unserer Ansicht nach besteht der Hauptunterschied zu einem herkömmlichen Mikroskop in der Entkopplung von Beleuchtung und Detektion. Daher ist diese relative Ausrichtung entscheidend für die beste Abbildungsleistung. Darüber hinaus wurden Bildgebungsschemata entwickelt, um automatisch die besten Winkel bei SPIM-Aufnahmen31 zu finden oder die Beleuchtungsdosis in der hochauflösenden Mikroskopie84,85 und der Multiphotonenmikroskopie86,87,88 anzupassen. Darüber hinaus führte die automatische Anpassung des Bildgebungsvolumens zur Anpassung an die Probenmorphologie zu einer drastischen Reduzierung der Bildgebungsdauer und der Gesamtlichtdosis und somit zu einer Verbesserung der Probengesundheit89,90,91.

Um zwischen Bildgebungsmodalitäten zu wechseln (Abb. 3c), sind Mechanismen zur Erkennung interessanter Ereignisse erforderlich. Die Ereigniserkennung beruht dabei auf der frühzeitigen Erkennung von Veränderungen in biologischen Strukturen oder Verhaltensweisen, wie etwa einer bevorstehenden Zellteilung oder Zellsignalisierung, um nur einige Beispiele zu nennen. In einer frühen Implementierung der ereignisgesteuerten Mikroskopie führten Almada et al.92 eine unbeaufsichtigte, ereignisgesteuerte Probenbehandlung mit hohem Inhalt und Live-to-Fixed-Bildgebung durch. Dabei stützten sie sich auf die Rundung mitotischer Zellen als biologischen Hinweis, der durch spontane Zellsegmentierung mit Otsu-Schwellenwert ermittelt wurde. Alvelid et al.93 kombinierten Weitfeldbildgebung zur Ereigniserkennung mit STED-Superauflösungsbildgebung und entwickelten eine automatisierte Multiskalenmethode, um Proteinrekrutierung, Vesikeltransport und Biosensoraktivität selektiv mit hoher Auflösung abzubilden. Mithilfe der GPU-beschleunigten Spitzenerkennung konnten sie eine Datenverarbeitung im Millisekundenbereich realisieren. Darüber hinaus versprechen GPU-basierte Deep-Learning-Netzwerke wie die U-Net-Architektur94 (Abb. 3d) aufgrund ihrer inhärent schnellen, parallelen Verarbeitung großer Bilder nach dem Training und der aktiven Entwicklung spezialisierter Hardware, wie z. B Tensor Processing Units (TPU)95. Mahecic et al.96 nutzten ein solches Netzwerk zur Ereigniserkennung bevorstehender mitochondrialer und bakterieller Teilungen und ermöglichten so eine selektive schnelle Bildgebung dieser Prozesse mit Geschwindigkeiten, die ihrer zeitlichen Dynamik entsprechen.

Während die Live-Bildgebung derzeit der Haupttreiber solcher intelligenten Erfassungssysteme ist, gehen wir davon aus, dass sie auch bei der Erforschung gereinigter Organe und sogar ganzer Tiere wichtig werden. Obwohl die Zeit keine harte Barriere darstellt, ist sie immer noch ein Faktor, da alle Proben nicht mehr leben. Dies gilt insbesondere für wiederholte Experimente und insbesondere in klinischen Umgebungen, in denen Biopsien im mm-Bereich Routine sind und eine zelluläre Auflösung für eine genaue Identifizierung des Zelltyps für die Prognose erreicht werden muss. Auch die Datenmenge, die durch die Abbildung großer, freigelegter Gewebe entsteht, ist nicht zu unterschätzen, insbesondere im Zusammenhang mit der Expansionsmikroskopie. Intelligente Bildgebungsverfahren werden daher von entscheidender Bedeutung sein, um gereinigtes Gewebe zu untersuchen und nur in interessierenden Bereichen autonom auf Bildgebung mit höherer Auflösung umzuschalten.

Das Herzstück intelligenter und adaptiver Mikroskoproutinen ist die Mikroskopsteuerungssoftware, die adaptive Steuerungsschemata und Ereigniserkennung ermöglicht. In den verfügbaren Implementierungen wurde die Bedeutung von Open-Source-Steuerungssoftware deutlich. Open-Source-Software ermöglicht die Steuerung und Änderung aller Aspekte der Mikroskoperfassung und Integration mit verfügbarer schneller Bildanalysesoftware. Angeführt werden diese Bemühungen durch Open-Source-Software wie Micro-Manager97, Pycro-Manager98, AutoScanJ99 oder andere Python-basierte Steuerungssoftware100,101. Da Open-Source-Software oft von wenigen Mitwirkenden entwickelt und gepflegt wird, bleibt es eine Herausforderung, Skripte zu warten und an neue Hardware anzupassen sowie neue Verarbeitungsalgorithmen im laufenden Betrieb zu integrieren. Daher ist die Modularität der Software von wesentlicher Bedeutung, und die Containerisierung von Bildverarbeitungsabläufen könnte zur Aufrechterhaltung der Kompatibilität beitragen und mehrere Softwareumgebungen auf einem Computer ermöglichen102,103. Wir glauben, dass es für kommerzielle Mikroskopanbieter von größter Bedeutung sein wird, Schnittstellen zu diesen Open-Source-Tools bereitzustellen. Eine Möglichkeit, dies zu erreichen, könnte darin bestehen, durch Netzwerknachrichten ausgelöste Ereignisse in den Erfassungsprotokollen zu ermöglichen99.

Während die Grundlagen für intelligente und adaptive Mikroskope gelegt wurden, hat die Ära der intelligenten Mikroskope gerade erst begonnen. In Anerkennung der Fortschritte, die Deep-Learning-Netzwerke in anderen Bereichen wie der Sequenz-zu-Struktur-Vorhersage mit AlphaFold104 und groß angelegten generativen Sprachmodellen mit GPT105 erzielt haben, stellen wir uns Mikroskopexperimente vor, bei denen ein Benutzer Schlüsselwörter wie „Alle Endozytoseereignisse erfassen“ eingeben könnte. und das Mikroskop würde diese Ereignisse dann systematisch in der Probe abbilden.

Dies würde das Training von Deep-Learning-Netzwerken mit universellen Kenntnissen grundlegender biologischer Konzepte und der Verknüpfung biologischer Begriffe mit ihren visuellen mikroskopischen Erscheinungen erfordern. Die zunehmende Verfügbarkeit öffentlicher Bildspeicher, z. B. der Image Data Resource106, und die jüngste Richtlinie des NIH, alle mit einer Veröffentlichung verbundenen Bilddaten verfügbar zu machen, könnten ein erster Schritt in diese Richtung sein, um solche Netzwerke zu trainieren. Es bleiben Herausforderungen bestehen, zum Beispiel könnte die Verfügbarkeit riesiger Mengen an Mikroskopdaten mit unzureichender Annotation dazu führen, dass diese weniger wirkungsvoll sind, um die erwarteten Deep-Learning-Netzwerke für die Mikroskopie zu trainieren. Entscheidend ist, dass Bilder im Gegensatz zu natürlicher Sprache nicht an ein standardmäßiges visuelles „Wörterbuch“ oder „Vokabular“ gebunden sind, sondern selbst für dieselbe Biologie eine erhebliche visuelle Heterogenität aufweisen. Es bleibt eine offene Frage, wie die Generalisierbarkeit und Skalierbarkeit aller trainierten Netzwerke über einen einzelnen biologischen Prozess und ein einzelnes Labor hinaus sichergestellt werden kann. Darüber hinaus wird die Ausbildung eines solchen universellen Mikroskopienetzwerks wahrscheinlich erhebliche Kosten verursachen, die derzeit für Mikroskopinstitute und schon gar nicht für einzelne Labore unerschwinglich sind. Um einige dieser Einschränkungen zu überwinden, haben sich selbstüberwachende Deep-Learning-Netzwerke als erfolgversprechend bei der Identifizierung ähnlicher morphologischer Merkmale in großen Repositories von Histologiebildern ganzer Objektträger erwiesen, unabhängig von der Bildgröße des Repositorys und fast ohne Anmerkungen107. Die Entwicklung von Techniken zum Lernen aus nur schwacher oder begrenzter Aufsicht108 oder zum Einsatz von Expert-in-the-Loop-Lernen109 zur Kommentierung und Verfeinerung der „schwierigen“ Fälle könnte ebenfalls eine vielversprechende kosteneffiziente Möglichkeit zur Skalierung des Lernens darstellen.

Auf ähnliche Weise könnten „unüberwachte“ Wahrscheinlichkeitsmodelle die Verteilung verfügbarer Bilder lernen, um die Suche nach seltenen Ereignissen zu ermöglichen und so bisher unbekannte Biologie aufzudecken. Ein Beispiel für solch einen seltenen Fund durch menschliche Annotatoren war die Entdeckung von Strukturen im Gehirngefäßsystem von Zebrafischen, die als Kugeln110 bezeichnet werden, nach vielen Jahren der Forschung und Bildgebung des Gehirngefäßsystems von Zebrafischen. In Zukunft könnte ein intelligentes Mikroskop solche Entdeckungen selbst präsentieren.

Eine weitere aktuelle Einschränkung für die Verarbeitung im laufenden Betrieb ist der Zeitaufwand für die Datenverarbeitung, da ein Lichtblattmikroskop problemlos Gigabytes an Daten innerhalb von Sekunden erzeugen kann. Wir erwarten jedoch in absehbarer Zeit erhebliche Fortschritte in Richtung schnellerer Verarbeitungspipelines. Neben Fortschritten bei besseren Algorithmen wird diese Beschleunigung teilweise durch Fortschritte bei der Computerhardware bedingt sein. Aktuelle Computerarchitekturen basieren immer noch überwiegend auf diskreten, geteilten CPU- und GPU-Speichern, was eine langsame Datenübertragung zwischen ihnen erfordert. Wir gehen davon aus, dass die Mikroskopakquise in Zukunft auf einer einzigen physischen Speicherressource (z. B. Soc-DRAM) basieren wird, die von CPU und GPU gemeinsam genutzt wird und derzeit z. B. auf NVIDIA Jetson111 verfügbar ist, wodurch das Hin- und Herkopieren von Daten zwischen CPU und GPU entfällt und somit erleichtert wird Das Beste aus beiden Welten steht für schnelle Verarbeitung zur Verfügung – möglicherweise sogar auf dem Kamerachip. Dabei könnte die Mikroskopie von der Entwicklung von Werkzeugen profitieren, die autonomes Fahren ermöglichen, bei dem eine große Anzahl von Bildern im laufenden Betrieb analysiert wird, um Gefahren auf der Straße, andere Autos oder Fußgänger zu identifizieren.

Neben der Änderung der Bildgebungsparameter und -module während der Aufnahme mit intelligenten und adaptiven Bildgebungsschemata können Aufnahmeschemata entwickelt werden, bei denen ein Bilddatensatz mit höherer Auflösung nach der Aufnahme aus einem Scan mit niedriger Auflösung oder einem Scan, der absichtlich fehlende Regionen enthält, rekonstruiert wird. Dies hat das Potenzial, die Gesamtlichtdosis auf der Probe, das erfasste Datenvolumen und die Erfassungszeit erheblich zu reduzieren. Nach der Bildrekonstruktion wird die Auflösung des ursprünglichen Bildgebungssystems wiederhergestellt oder sogar erhöht, wodurch die herkömmlichen Kompromisse bei der Bildgebung überwunden werden (Abb. 3a). Angesichts der Fortschritte in der Theorie der Bildrekonstruktion mit Compressed Sensing-112,113,114 und maschinellen Lernansätzen115,116,117,118 gehen wir davon aus, dass solche Algorithmen in Zukunft immer weiter verbreitet werden.

Compressed Sensing112,113,114 ist ein mathematisches Rahmenwerk, das beschreibt, wie Signale (Bilder) mit Raten erfasst und dargestellt werden, die deutlich unter der Nyquist-Rate liegen. Die Theorie des Compressed Sensing basiert traditionell auf drei Konzepten: Sparsity, Inkohärenz und Zufallsstichprobe119. Wenn alle drei gegeben sind, kann eine erfolgreiche Rekonstruktion eines unterabgetasteten Signals erreicht werden. Ein Signal ist dünn besetzt, wenn es in einem bestimmten Bereich oder einer bestimmten Basis mit nur wenigen Parametern ungleich Null dargestellt werden kann. Daher ist die Sparsity-Beschränkung für die Fluoreszenzmikroskopie normalerweise erfüllt, da sie in ihrer Pixeldarstellung häufig bereits spärlich sind (z. B. wenige selektiv markierte Strukturen) oder leicht komprimiert werden können, was bedeutet, dass eine Basis vorhanden ist, z. B. in Wavelets wobei viele Komponenten Null sind. Allerdings mangelt es in der Mikroskopie oft an Inkohärenz (die Werte in der Messmatrix sind gleichmäßig verteilt) und einer einheitlichen Zufallsauswahl119. Schließlich erfassen aktuelle Bildsensoren Daten deterministisch über ein 2D-Array und nicht zufällig. Dennoch wurde die Anwendung von Compressed Sensing erfolgreich demonstriert und neue Prinzipien für Compressed Sensing eingeführt, um die Lücke zwischen Theorie und Praxis zu schließen: asymptotische Inkohärenz, asymptotische Sparsity und Multilevel-Sampling119.

Es wurden mehrere erfolgreiche Anwendungen von Compressed Sensing in der Bildgebung und Mikroskopie demonstriert120. Zu diesen Anwendungen gehört eine massiv beschleunigte Bildrate von Kameras, die 100 Milliarden Bilder pro Sekunde erreicht121. Darüber hinaus wurde Compressed Sensing auf einem Gitterlichtblattmikroskop und einem Epifluoreszenzmikroskop implementiert, um die Lichtexposition und die Aufnahmezeit um das Fünf- bis Zehnfache zu reduzieren122, und für die anatomische Hochdurchsatzbildgebung ganzer Mausgehirne von ~400 mm3 auf einer Zeitskala von angewendet ~10 Min.123. Wichtig ist, dass die Compressed-Sensing-Rekonstruktion unbeaufsichtigt ist und keine vorherigen Trainingsdaten erfordert. Darüber hinaus verbessert sich die Rekonstruktionsgenauigkeit mit zunehmender Auflösung124. Dies macht Compressed Sensing zu einer attraktiven Technik für die Zukunft intelligenter Lichtblatt-Bildgebungsverfahren mit mehreren Auflösungen.

Ebenso können Deep-Learning-Netzwerke die Bildwiederherstellung aus Trainingsdaten erlernen125,126,127. Dadurch kann Deep Learning mehrere Einschränkungen des Compressed Sensing beseitigen126. Traditionell erfordert Compressed Sensing ein handgefertigtes Rekonstruktionsverfahren, das für anspruchsvolle Bildmodelle möglicherweise schwierig zu etablieren ist. Darüber hinaus basieren solche Rekonstruktionsverfahren auf iterativen inversen Optimierungsalgorithmen, deren korrekte Abstimmung tendenziell langsam und schwierig ist, sodass eine Rekonstruktion in Echtzeit schwer zu erreichen ist. Im Gegensatz dazu erfordert die Rekonstruktion mit Deep Learning nur eine einzige schnelle Vorwärtsausbreitung durch das Netzwerk. Darüber hinaus ist die für die komprimierte Erfassung erforderliche (asymptotische) Inkohärenz der Daten für Deep-Learning-Netzwerke nicht unbedingt erforderlich, im Gegensatz dazu könnten sie von kohärenten Daten profitieren. Es überrascht daher nicht, dass Anwendungen von Deep Learning für Bildrekonstruktionen daher ein sehr aktives Forschungsgebiet sind und für diese Aufgabe eine Vielzahl von Netzwerken entwickelt wurden126,127.

Deep Learning steht jedoch vor mehreren Herausforderungen. Deep-Learning-Modelle bieten noch nicht die Generalisierung, Robustheit und Stabilität der Rekonstruktionen, die das etablierte Compressed Sensing bietet, und leiden unter Halluzinationen, d. h. der Entstehung realistisch aussehender Artefakte127,128. Dies hängt mit der Frage zusammen, wie gut trainierte Netzwerke außerhalb ihres Trainingssatzes und der Modellgerechtigkeit verallgemeinern, also der Fähigkeit von Modellen, sowohl häufige als auch seltene Phänotypen gleichermaßen zu erfassen und darzustellen. Wir erwarten in den nächsten Jahren erhebliche Fortschritte bei der Beantwortung dieser Fragen. Die Angabe der Quantifizierung von Unsicherheiten wird daher für die Interpretation von Rekonstruktionen von entscheidender Bedeutung sein. Zu diesem Zweck gibt es Modelle wie die Bayes'sche Inversion129 und Techniken wie den Bayes'schen Dropout130, um Unsicherheitsmaße aus Deep-Learning-Modellen zu generieren. Die Genauigkeit der Unsicherheitsmaße erfordert jedoch eine weitere externe Bewertung, um festzustellen, ob sie in der Lage sind, aleatorische und epistemische Unsicherheit zu berücksichtigen131,132.

Darüber hinaus hängt der datengesteuerte Ansatz von Deep-Learning-Netzwerken von der Verfügbarkeit guter (Größe, Ausgewogenheit und Qualität) Trainingsdaten ab, die die beabsichtigte Anwendung widerspiegeln. Dies gilt insbesondere für die Bildrekonstruktion, die eine Ausgabe mit Daten höchster Auflösung erfordert, im Gegensatz zu Klassifizierungsaufgaben und (binären) Segmentierungen, bei denen es sich im Wesentlichen um grobe Daten handelt. Während jedoch beliebte Netzwerke wie GPT105 mit begrenzten Einschränkungen auf eine Fülle verfügbarer Daten angewiesen sind, handelt es sich bei der Bildrekonstruktion in der Mikroskopie in der Regel um Spezialanwendungen mit kleinen Datensätzen. Eine Hoffnung besteht darin, dass in Zukunft mit der Verpflichtung, alle einer Veröffentlichung beigefügten Mikroskopdaten zu hosten, letztendlich wesentlich mehr und besser kommentierte Trainingsdaten verfügbar sein werden. Darüber hinaus kann die Datenerweiterung, z. B. durch geometrische Transformationen wie Bilddrehungen, die Datengröße erhöhen133. Darüber hinaus könnte die Anwendung eines Deep-Learning-Netzwerks, das für verschiedene Aufgaben auf vielfältigere und größere Datensätze vorab trainiert wurde, von Vorteil sein, ein Konzept, das als Transferlernen bekannt ist134. Darüber hinaus können Meta-Learning-Ansätze135,136 zum gezielten Trainieren von Netzwerken in der Umgebung mit wenigen Bildern zu leistungsfähigeren Netzwerken im realen Einsatz führen. In ähnlicher Weise können physikalisch fundiertere Deep-Learning-Netzwerkarchitekturen, die den Bilderzeugungsprozess modellieren, dazu beitragen, realistische Vorhersagen zu gewährleisten und die Anzahl freier Parameter zu reduzieren, um schnelleres, besser verallgemeinerbares Lernen zu ermöglichen137,138. Schließlich kann die Einführung eines kontinuierlichen Lernparadigmas anstelle einer einmaligen Schulung dazu beitragen, sich kontinuierlich an neue Daten- und Bildgebungsbedingungen anzupassen.

Trotz dieser Bedenken wurden Deep-Learning-Wiederherstellungstechniken erfolgreich eingesetzt und wurden sogar von der FDA für ausgewählte Anwendungen wie CT-Scans zugelassen139. In der hochauflösenden Mikroskopie wurde über erhebliche Verbesserungen der Aufnahmegeschwindigkeit durch Wiederherstellung berichtet140,141,142. Für die Lichtblattmikroskopie haben Deep-Learning-Netzwerke wie CARE143 das SNR-Verhältnis von Bildern verbessert, die mit weniger Laserleistung oder schnellerer Belichtung aufgenommen wurden. Interessanterweise wurden auch Deep-Learning-Netzwerke eingesetzt, um den Stichprobenprozess direkt zu beeinflussen. Horstmeyer et al. entwickelten Faltungs-Neuronale Netze, um die physische Anordnung eines Mikroskops zu optimieren und die Genauigkeit der Identifizierung von Malaria-infizierten Zellen um 5–10 % zu verbessern144. Wir gehen davon aus, dass zukünftige Entwicklungen diesen Weg der gemeinsamen Optimierung der Bilderfassung mit Deep-Learning-Netzwerken für die Analyse weiter nutzen werden. Das Verständnis sowohl des Bildgebungssystems als auch des Prozesses wird dadurch zu schnelleren Verarbeitungszeiten und besseren Rekonstruktionen führen138.

Letztlich ist es auch wichtig zu erkennen, dass ein Bild oft ein Zwischenschritt zur Quantifizierung eines biologischen Prozesses ist. Daher ist für viele Studien ein visuell ansprechendes, durch Deep Learning rekonstruiertes Bild möglicherweise weniger wichtig als Bilddaten mit streng quantifizierbaren Schlussfolgerungen. Dies könnte einige der oben beschriebenen Herausforderungen lindern, erfordert jedoch ein genaues Verständnis des Bildgebungssystems und der Bilderzeugung. Zu diesem Zweck haben Pégard et al. demonstrieren komprimierende Lichtfeldmikroskopie, die eine Echtzeitquantifizierung der Gehirnaktivität ermöglicht, ohne jemals ein 3D-Bild zu rekonstruieren145.

Wir gehen davon aus, dass die Lichtblatttechnologie selbst in Form von verfeinerten optischen Designs, besseren Detektoren, neuartigen Sonden, NIR-Bildgebungsfähigkeiten und möglicherweise nicht fluoreszierenden Kontrastmethoden wie der Raman-Streuung Fortschritte machen wird. Einige technische Aspekte der Lichtblatt-Technologie können jedoch maximal optimiert werden, beispielsweise die numerische Apertur, die in einem Lichtblatt-Mikroskop abgedeckt werden kann146,147. Weitere Fortschritte in diesem Bereich würden wahrscheinlich auch die Praktikabilität des Instruments beeinträchtigen. Dies ist auf die orthogonale Konfiguration des LSFM und die Tatsache zurückzuführen, dass Objektive mit hoher NA einen großen Öffnungswinkel benötigen. Folglich geht eine Verbesserung der lateralen Auflösung über einen bestimmten Schwellenwert hinaus mit einer Verringerung der axialen Auflösung einher und umgekehrt, da die Anregungs- und Detektionslichtkegel einen begrenzten Raumwinkel teilen.

Stattdessen glauben wir, dass die zukünftige Wirkung von Lichtblattsystemen stark von ihrer Praktikabilität und Anwendbarkeit auf biologische und biomedizinische Forschungsfragen abhängt. Viele traditionelle Lichtblattdesigns erfordern eine nicht-traditionelle Probenmontage5,36 und bieten nur begrenzten Platz für die Probe selbst (Abb. 1a).

Eine vielversprechende Alternative sind oben offene37,148 und Schrägebenenmikroskope (OPM)8,28,149, die einen halben Raum frei lassen (Abb. 4a), um Proben im Prinzip beliebiger Größe zu platzieren. Fortschritte im optischen Design dieser Mikroskope haben Mikroskope mit einem großen Sichtfeld im Millimeterbereich150,151,152,153,154 und Mikroskope mit hoher Auflösung8,155 und sogar mit beiden Modalitäten ermöglicht156. In jüngster Zeit wurden auch kommerzielle Mikroskope auf Basis der Open-Top-Mikroskopie entwickelt157. Daher glauben wir, dass Open-Top- und OPM-Systeme eine weit verbreitete Einführung der Lichtblattmikroskopie ermöglichen werden, da herkömmliche Methoden zur Probenmontage eingesetzt werden können und eine Integration in Standard-Mikroskopkörper mit OPM grundsätzlich möglich ist. Dies eröffnet den Weg für die dreidimensionale Hochdurchsatz-Bildgebung mithilfe von Platten mit mehreren Vertiefungen, die Bildgebung toxischer oder infektiöser Proben in (versiegelten) Schalen und multimodale Bildgebungsansätze (Abb. 4b).

Die Oblique Plane Light-Sheet Microscopy (OPM) ist ein Beispiel für oben offene Geometrien, bei denen ein Primärobjektiv mit hoher NA sowohl für die Beleuchtung (blau) als auch für die Detektion (drei fluoreszierende Emitter entlang der Lichtscheibe, dargestellt in dunkelgrünem Licht) sorgt Grün zeigt die von OPM gesammelte Fluoreszenz dieser drei Emitter. Dadurch entfällt die Notwendigkeit zusätzlicher Beleuchtungsobjektive wie bei herkömmlichen Lichtblattmikroskopen und bietet somit neuen verfügbaren optischen Designraum und eine verbesserte Zugänglichkeit. Um ein 3D-Volumen zu scannen, wird das Lichtblatt über das Objektiv gescannt und es ist keine Tisch- oder Probenbewegung erforderlich. b OPM erleichtert die Lichtblattmikroskopie für (i) neuartige Hochdurchsatz-Multiwell-Anwendungen und Mikrofluidikgeräte, (ii) die Bildgebung neuer Sonden, die versiegelt sind, um Kontaminationen über lange Zeiträume zu reduzieren, und die Bildgebung von Krankheitserregern wie Bakterien usw Viren, (iii) und Kombinationen mit anderen Modalitäten wie Atomic Force Microscopy (AFM).

Open Top und OPM haben auch neue Designräume für die optische Technik eröffnet. OPM basiert auf der Remote-Refokussierung158, die die Fähigkeit beschreibt, ein aberrationsfreies 3D-Bild der Probe in einem entfernten Raum von der Probe zu erstellen. Die geneigte Lichtblattebene innerhalb dieses 3D-Bildes kann dann mit einem anderen Mikroskop auf eine Kamera abgebildet werden. Während das Fernfokussierungsprinzip158, das OPM zugrunde liegt, bereits vor über einem Jahrzehnt etabliert wurde, wurde es kürzlich erneut analysiert159, um eine Bildgebung über verschiedene Brechungsindizes hinweg zu ermöglichen. Die neuen Erkenntnisse könnten eine hochauflösende Lichtblatt-Bildgebung in beliebigen Immersionsmedien ermöglichen und so die Vielseitigkeit und Anwendbarkeit der Lichtblatt-Mikroskopie erweitern. Dies sollte nur als Beispiel dafür dienen, wie Verbesserungen durch Entdeckungen optischer Prinzipien und Theorie sowie durch Technik erzielt werden können.

Wir gehen davon aus, dass die Lichtblattmikroskopie in Zukunft eine wichtige Rolle in den biomedizinischen Wissenschaften und klinischen Anwendungen für die mikroskopische und makroskopische Bildgebung spielen wird. Seine Kombination aus schneller und dennoch sanfter volumetrischer Bildgebung wird als Grundlage für physiologisch relevante Studien der Zellbiologie in Zellkulturen, in Organoiden, in (technisch hergestelltem) Gewebe, in klinischen Biopsien und an ganzen Tieren dienen. Daher kann man große Träume haben, eine Zukunft, in der die subzelluläre Biologie live in ihrem natürlichen Kontext untersucht werden kann, ohne die Einschränkungen, die traditionelle Zellkulturmethoden auf Deckgläsern mit sich bringen.

Um diesen Traum zu verwirklichen, erwarten wir, dass Lichtblattmikroskope die volumetrischen und zeitlichen Bildbarrieren überwinden, die durch Einschränkungen der Mikroskopsysteme und der Probe entstehen. Dies wird keine Aufgabe mehr sein, die ein menschlicher Mikroskopbediener oder Bildanalytiker alleine bewältigen kann. Stattdessen werden neuartige intelligente und adaptive Mikroskopsteuerungssysteme Proben auf autonome, selbstfahrende Weise untersuchen, um interessierende Prozesse selektiv mit Geschwindigkeiten abzubilden, die ihrer Dynamik entsprechen. Diese Systeme werden neue autonome biologische Entdeckungen und systematische bildgebende Untersuchungen von Prozessen ermöglichen, die über mehrere Längen- und Zeitskalen ablaufen.

Neben einem höheren Durchsatz versprechen solche Erfassungssysteme auch die Eindämmung der Datenflut. Aktuelle Lichtblattdaten können bereits Petabyte-Größen erreichen und werden wahrscheinlich bald sogar noch höhere Größenordnungen erreichen. Da intelligente und adaptive Datenerfassungsschemata nicht mehr der Nyquist-Stichprobe auf der feinsten Ebene über den gesamten Datensatz folgen, wird die feinste Stichprobe nur noch selektiv angewendet. Darüber hinaus wird die algorithmische Auswahl von Interessengebieten menschliche Vorurteile beseitigen und so die Reproduzierbarkeit von Bildgebungsstudien verbessern.

Wie bei jedem Blick in die Zukunft ist es wahrscheinlich, dass das Feld sehr unterschiedliche Richtungen einschlagen könnte. Denn wer hätte schon vor 2015 mit der Expansionsmikroskopie54,55 gerechnet, die die Fluoreszenzmikroskopie in unvorstellbarer Weise beeinflusst hat. Während wir also von den Möglichkeiten, die wir hier beschrieben haben, begeistert sind, hoffen wir auch, dass die Mikroskop-Community genauso einfallsreich bleibt wie in den letzten 20 Jahren und viele weitere Überraschungen bereithält.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

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Wir danken den National Institutes of Health (Fördernummer R35GM133522) für die Unterstützung. Die Autoren danken Dr. Anna Bajur, Dr. Kevin Dean und Dr. Felix Zhou für Kommentare und Feedback zum Manuskript.

Lyda Hill Abteilung für Bioinformatik, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA

Stephan Daetwyler & Reto Paul Fiolka

Abteilung für Zellbiologie, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA

Stephan Daetwyler & Reto Paul Fiolka

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SD und RF konzipierten und schrieben das Manuskript.

Korrespondenz mit Reto Paul Fiolka.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Manuel Breuer.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Daetwyler, S., Fiolka, RP Lichtblätter und intelligente Mikroskopie, eine aufregende Zukunft bricht an. Commun Biol 6, 502 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04857-4

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Eingegangen: 4. Februar 2023

Angenommen: 20. April 2023

Veröffentlicht: 09. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04857-4

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