Evaluierung von Extraktionsmethoden für ungezielte metabolomische Studien für zukünftige Anwendungen in Zebrafischlarven-Infektionsmodellen

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 7489 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Probenvorbereitung in der ungezielten Metabolomik sollte eine reproduzierbare Extraktion möglichst vieler Moleküle ermöglichen. Daher ist die Optimierung der Probenvorbereitung von entscheidender Bedeutung. In dieser Studie wurden sechs verschiedene Extraktionsverfahren verglichen, um das am besten geeignete für die Extraktion von Zebrafischlarven im Kontext eines Infektionsmodells zu finden. Es wurden zwei einphasige Extraktionen unter Verwendung von Methanol (I) und einer einzelnen mischbaren Phase aus Methanol/Acetonitril/Wasser (II) und zwei zweiphasige Methoden unter Verwendung einer Phasentrennung zwischen Chloroform und Methanol/Wasser-Kombinationen (III und IV) getestet. Für die Methoden III und IV (III_B und IV_B) wurde eine zusätzliche Perlenhomogenisierung verwendet. Für die Methodenbewertung wurden neun interne Standards und 59 Moleküle von Interesse (MoInt) im Zusammenhang mit einer Mykobakterieninfektion verwendet. Zweiphasenmethoden (III und IV) führten im Vergleich zu Einphasenextraktionen zu einer geringeren Merkmalsanzahl, höheren Peakflächen von MoInt, insbesondere Aminosäuren, und höheren Variationskoeffizienten. Durch das Hinzufügen der Perlenhomogenisierung wurden die Anzahl der Merkmale, die Peakflächen und die CVs erhöht. Extraktion I zeigte höhere Peakflächen und niedrigere CVs als Extraktion II und ist daher die am besten geeignete Einphasenmethode. Extraktion III und IV zeigten ähnliche Ergebnisse, wobei III einfacher durchzuführen war und weniger anfällig für Ungenauigkeiten war. Daher könnten für zukünftige Anwendungen in der Metabolomik von Zebrafischlarven und Infektionsmodellen die Extraktionen I und III ausgewählt werden.

Metabolomik zielt darauf ab, Veränderungen von Molekülen < 1500 Da (Metabolom), die zu einem bestimmten Zeitpunkt in einem Organismus oder einem Modellsystem vorhanden sind, analytisch zu profilieren1,2. Das Metabolom umfasst endogene Metaboliten sowie Metaboliten, die aus exogenen Quellen wie Arzneimitteln stammen. Während gezielte Ansätze auf der Quantifizierung ausgewählter Metaboliten basieren, oft aus einer bestimmten Gruppe von Metaboliten, zielt die ungezielte Metabolomik darauf ab, so viele Metaboliten wie möglich zu erkennen1,2,3. Zu den häufig angewandten Analysetechniken für die Probentrennung gehören Flüssigkeitschromatographie (LC) und Gaschromatographie, die beide regelmäßig mit Massenspektrometrie gekoppelt sind1,2,3. Die LC-Trennung bei nicht zielgerichteten Ansätzen erfolgt häufig unter Verwendung von Umkehrphasensäulen für die Trennung unpolarer Metaboliten, Normalphasensäulen für die Trennung polarer Metaboliten oder hydrophiler Interaktionsflüssigkeitschromatographie (HILIC)-Säulen als Variationen von Normalphasensäulen eine Wasserschicht über ihrer stationären Phase, was zu einer Trennung führt, die hauptsächlich auf der Flüssig-Flüssig-Verteilung basiert. Phenyl-Hexyl-Säulen sind Umkehrphasensäulen mit einzigartiger Selektivität für aromatische Moleküle. Nach der Trennung der Metaboliten werden diese ionisiert, üblicherweise mittels Elektrospray-Ionisation (ESI) oder Atmosphärendruck-Ionisation, und mit einem Massenanalysator, häufig Orbitrap oder Flugzeitinstrumenten, analysiert1,2. Fragmentierungsspektren können in derselben Analyse, beispielsweise durch datenabhängige oder datenunabhängige Erfassung, oder in einer nachfolgenden Analyse generiert werden. Die so generierten Daten können dann mit bioinformatischen Methoden wie Peakerkennung und Vorverarbeitung weiterverarbeitet werden, gefolgt von multivariaten Statistiken zur Auswertung und zum Vergleich der Fragmentierungsspektren mit Referenzbibliotheken zur Identifizierung1,2,3,4,5.

Um die Auswirkungen von Krankheiten, beispielsweise Tuberkulose6, zu verstehen und Biomarker für eine Diagnose oder einen Behandlungserfolg zu finden, wird häufig Metabolomik eingesetzt und die Veränderung des Wirtsmetaboloms beobachtet. Insbesondere wurden Veränderungen am endogenen Metabolom, die durch eine Infektion mit Mycobacterium tuberculosis verursacht werden, ausführlich an Menschen4,5,6,7 und Tiermodellen8, einschließlich Mäusen, Meerschweinchen, Kaninchen und nichtmenschlichen Primaten9, untersucht. Die induzierten Veränderungen am Metabolom wurden auch anhand des nichttuberkulösen Mykobakteriums M. marinum in Zebrafischlarven (Danio rerio, ZF) als einem seiner natürlichen Wirte untersucht10. Ein solches ZF-Modell unter Verwendung von M. marinum ähnelt den granulomähnlichen Strukturen, die typischerweise in seinem Säugetier-Gegenstück zu finden sind11,12,13,14. Das ZF-Genom ist zu etwa 70 % mit dem des Menschen identisch15 und in mehreren Studien wurde über einen ähnlichen Metabolismus wie beim Menschen berichtet, sowohl hinsichtlich des xenobiotischen Metabolismus16,17,18,19 als auch des Wirtsmetaboloms im Falle einer Infektion20,21. Das ZF-Larvenmodell bietet weitere Vorteile, darunter die einfache Handhabung, die optische Transparenz von Embryonen und Larven sowie geringere finanzielle Kosten im Vergleich zu anderen Organismen22,23. Darüber hinaus gelten Experimente mit Embryonen und Larven, die jünger als 120 Stunden nach der Befruchtung (hpf) sind, nicht als Tierversuche innerhalb der Europäischen Union (EU-Richtlinie 2010/63/EU)24. Aufgrund der Vielzahl an Vorteilen sind ZF-Studien mit ungezielter Metabolomik heutzutage immer häufiger anzutreffen25,26, werden jedoch im Zusammenhang mit Krankheiten und insbesondere M. marinum nur selten eingesetzt20.

Während vorläufiger Studien zur Implementierung eines M. marinum-Infektionsmodells in ZF-Larven führte der Mangel an Probenmaterial aufgrund der geringen Größe der ZF-Larven zu einer geringen Signalintensität der Metaboliten und führte zu fehlenden Metaboliten und schlechter Wiederholbarkeit. Eine Optimierung der eingesetzten Methoden, insbesondere der Probenvorbereitung, wurde als notwendig erachtet. Um einen ausreichend großen Teil des Metaboloms abzudecken, werden häufig Kombinationen verschiedener Methoden zur Extraktion, Trennung oder Identifizierung verwendet1,2,3,27,28.

Häufig verwendete Flüssigextraktionen für ZF-Larven und anderes Fischgewebe basieren oft auf Einphasenextraktionen, die aus einem oder mehreren mischbaren Lösungsmitteln wie Methanol, Acetonitril und Wasser29 oder ausschließlich Methanol19 bestehen. Sie basieren ebenfalls auf Zweiphasenmethoden, die aus zwei nicht mischbaren Lösungen30 bestehen und eine Phasentrennung zwischen einer lipophilen und einer hydrophilen Phase nutzen. Die gebräuchlichsten Zweiphasenmethoden verwenden eine polare Lösung, z. B. Mischungen aus Methanol und Wasser, und eine unpolare Lösung, z. B. Chloroform31,32, Methyl-tert-butylether33 oder Heptan34.

Ein weiterer Ansatz ist die Anwendung einer zusätzlichen Probenhomogenisierung. Während einige Gewebeproben direkt mit Lösungsmitteln extrahiert werden können, sind bei resistenteren Geweben zusätzliche Abbauschritte erforderlich. Zu diesen Methoden gehören die chemische Homogenisierung, die den Nachteil einer möglichen Beeinträchtigung des Metaboloms oder der folgenden Extraktionsprozesse mit sich bringt, oder die mechanische Homogenisierung der Larven, z. B. durch Mahlen, Schlagen der Larven mit Perlen oder Ultraschall35.

Ziel dieser Studie war es, verschiedene Probenextraktionsverfahren, darunter einphasige, zweiphasige und zweiphasige Verfahren mit mechanischer Homogenisierung, zu vergleichen, um das am besten geeignete für die zukünftige Verwendung in einem M. marinum ZF-Larveninfektionsmodell zu finden. Basierend auf mehreren Qualitätsbewertungsstrategien wurden verschiedene Methoden unter Einbeziehung interner Standards, sogenannter „Molecules of Interest“ (MoInt), untersucht und Fallstricke sowie Verbesserungen aufgezeigt.

Pronase und Methylenblau wurden von Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Deutschland) bezogen. NaCl, KCl, MgSO4, Ca(NO3)2 und 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) wurden von Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland) bezogen. Tryptophan-d5 wurde von Alsachim (Illkirch Graffenstaden, Frankreich) bezogen. Telmisartan-d7 wurde von Sigma (Taufkirchen, Deutschland) bezogen. Trimipramin-d3, Bisoprolol-d5, Furosemid, Glibenclamid und Hydrochlorothiazid wurden von LGC (Wesel, Deutschland) bezogen. Ammoniumformiat, Ammoniumacetat (beide analysenrein), Ameisensäure (LC-MS-Qualität), D-Glucose-d7 und Palmitinsäure-d31 wurden von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen. Acetonitril (ACN, LC-MS-Qualität), Methanol (MeOH, LC-MS-Qualität) und alle anderen Chemikalien und Reagenzien (analytische Qualität) stammten von VWR (Darmstadt, Deutschland). Chloroform (analytische Reagenzqualität) stammte von Fisher (Schwerte, Deutschland). Entionisiertes Wasser wurde mit einem Millipore-System (18,2 Ω × cm Wasserbeständigkeit) von Merck (Darmstadt, Deutschland) hergestellt. Reaktionsgefäße und Pipettenspitzen wurden von Sarstedt (Nümbrecht, Deutschland) bezogen. 2-ml-Homogenisatorröhrchen, vorgefüllt mit säuregewaschenen 0,5-mm-Glasperlen, wurden von Biozym (Hess, Deutschland) bezogen.

Die Haltung ausgewachsener ZF erfolgte im Einklang mit dem Tierschutzgesetz (§11 Abs. 1 TierSchG) und auf Basis bereits dokumentierter Methoden19,36. ZF-Larven innerhalb der ersten 120 hpf gelten nicht als Tierversuche gemäß der EU-Richtlinie 2010/63/EU. Die Zebrafischpflege, die Embryonenvorbereitung und die Probenentnahme bis hin zur Probenvorbereitung finden Sie im Ergänzungsmaterial.

Es wurden zwei einphasige Extraktionen (I–II) und zwei zweiphasige Extraktionen (III–IV) untersucht, wobei Extraktion I für Vorversuche genutzt wurde. Die zweiphasigen Extraktionen wurden zusätzlich in Kombination mit einer mechanischen Vorbehandlung mittels Glasperlenhomogenisierung bewertet.

Zur Perlenhomogenisierung, in den Ergebnissen als „_B“ angegeben, wurden 0,5 mm große Glasperlen aus vorgefüllten Homogenisierungsröhrchen (Biozym, Hess, Deutschland) zu den schockgefrorenen Proben gegeben. Die Proben wurden mit einem MP Biomedicals FastPrep24-Homogenisator (TF, Dreieich, Deutschland) für 20 s bei 6 m/s im Quick Prep-Modus homogenisiert und anschließend auf Eis gehalten. Bei der Extraktion wurden drei verschiedene Spike-Lösungen (1, 2 und 3) mit unterschiedlichem IS verwendet. Ihr Inhalt und die Peakauswahl des IS sowie m/z und Retentionszeit sind in Tabelle S1 zu finden.

Für Extraktion I, angepasst von Park et al., 180 µL MeOH und 20 µL interne Standardlösung Spike-Lösung 1 (25 µg/ml Tryptophan-d5, 1 mg/ml Palmitinsäure-d31, 50 µg/ml Glucose-d7 in MeOH) wurden jeder Probe zugesetzt19. Die Proben wurden 10 s lang gevortext und anschließend 10 min lang bei 4 °C und 21.500 × g zentrifugiert.

Für Extraktion II, adaptiert von Bai et al., wurden jeder Probe 80 µL MeOH, 100 µL ACN und 40 µL Millipore-Wasser sowie 20 µL Spike-Lösung 1 zugesetzt29. Die Proben wurden mit einem Ultraschallreiniger USC 100T (VWR, Darmstadt, Deutschland) 15 Minuten lang bei Raumtemperatur beschallt, 2 Stunden lang bei –20 °C inkubiert und anschließend 15 Minuten lang bei 4 °C und 21.500 × g zentrifugiert.

Für die Extraktionen III und III_B, adaptiert von Chai et al., wurden jeder Probe 180 µL MeOH und 80 µL Millipore-Wasser zusammen mit 20 µL Spike-Lösung 1 zugesetzt37. 200 µL Chloroform und 100 µL Millipore-Wasser wurden zugegeben und die Proben 1 Minute lang gevortext. Die Proben wurden 10 Minuten lang auf Eis inkubiert und dann 10 Minuten lang bei 4 °C und 13.800 × g zentrifugiert.

Für die Extraktionen IV und IV_B, angepasst von Ding et al., wurden 80 µL MeOH und 100 µL Millipore-Wasser zusammen mit 20 µL Spike-Lösung 1 zu jeder Probe hinzugefügt20. 200 µL Chloroform wurden hinzugefügt und die Proben wurden mit einem USC 100T Ultraschallreiniger (VWR, Darmstadt, Deutschland) 15 Minuten lang beschallt. Die Proben wurden 10 Minuten lang auf Eis inkubiert und anschließend 5 Minuten lang bei 4 °C und 2400 × g zentrifugiert. Die Arbeitsabläufe der einzelnen Extraktionsverfahren finden Sie in den Abbildungen. 1 und 2.

Arbeitsablauf für Extraktionsverfahren I und II. MeOH Methanol, ACN Acetonitril. Spike 1 Lösung 25 µg/ml Tryptophan-d5, 1 mg/ml Palmitinsäure-d31, 50 µg/ml Glucose-d7 in MeOH. Erstellt von BioRender.com und veröffentlicht auf Grundlage der akademischen Lizenzbedingungen.

Arbeitsablauf für Extraktionsverfahren III (III B) und IV (IV B). MeOH Methanol, ACN Acetonitril. Spike 1 Lösung 25 µg/ml Tryptophan-d5, 1 mg/ml Palmitinsäure-d31, 50 µg/ml Glucose-d7 in MeOH. Erstellt von BioRender.com und veröffentlicht auf Grundlage der akademischen Lizenzbedingungen.

Für die Extraktionen III, IV, III_B und IV_B wurde die untere lipophile Phase verworfen und nicht weiter analysiert, da der Analyseaufbau einschließlich der ESI-Ionisierung nicht für lipophile Metaboliten optimiert war und die meisten interessierenden Moleküle und internen Standards hydrophil waren.

Nach jedem Extraktionsvorgang wurde der Überstand jeder Probe in braune Glasfläschchen überführt und über Nacht bei –80 °C aufbewahrt. Ein Volumen von 10 µL Spike-Lösung 2 (1 µg/ml Trimipramin-d3 und 50 µg/ml Glibenclamid in MeOH) wurde zugegeben und das Lösungsmittel mit einer Vakuumzentrifuge (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) bei 30 °C entfernt die Einstellung für alkoholische Lösungen unter Vakuum (V-AL) für bis zu 2 h, abhängig vom Lösungsmittelvolumen. Anschließend wurde der Rückstand in 50 µL MeOH/ACN (70:30 v/v) rekonstituiert, das 0,01 µg/ml Bisoprolol-d5 und Telmisartan-d7 sowie 10 µg/ml Hydrochlorothiazid und Furosemid enthielt (Spike-Lösung 3). Der rekonstituierte Extrakt wurde 10 s lang gevortext und jede Probe wurde in einen Autosampler-Einlass überführt. Volumina von 5 µL jeder Probe wurden gepoolt und als QC-Probe verwendet. Die Proben wurden für den Transport zwischen den Einrichtungen auf Trockeneis aufbewahrt und bis zur Analyse bei –80 °C gelagert.

Die LC-HRMS/MS-Analyse wurde auf der Grundlage früherer Veröffentlichungen durchgeführt36,38 und Einzelheiten zur Instrumentierung finden Sie im ergänzenden Material. Kurz gesagt bestand das verwendete Gerät aus einer Thermo Fisher Scientific Dionex UltiMate 3000 RS-Pumpe, einschließlich Entgaser, quaternärer Pumpe und UltiMate Autosampler, gekoppelt mit einem TF Q-Exactive Plus (TF, Dreieich, Deutschland). Die Ionenquelle war eine beheizte Elektrospray-Ionisations-HESI-II-Quelle. Die Parameter für die HESI-II-Quelle wurden nach einer früheren Methode ausgewählt36.

Die Umkehrphasenchromatographie (RP) wurde auf einer TF Accucore Phenyl-Hexyl-Säule (100 mm × 2,1 mm, 2,6 μm, TF, Dreieich, Deutschland) und die hydrophile Wechselwirkungsflüssigkeitschromatographie (HILIC) unter Verwendung einer Nucleodur-Säule (125 mm × 3 mm) durchgeführt , 3 μm, Macherey-Nagel, Düren, Deutschland).

TF-Rohdateien wurden mit der TF Xcalibur-Softwareversion 4.1 auf Retentionszeit, Peakintensität und Peakform für alle IS und MoInt analysiert, um eine korrekte Erkennung, Identifizierung und mögliche Detektorsättigung sicherzustellen. Anschließend wurden die Rohdateien mit ProteoWizard39 in mzXML-Dateien konvertiert. Die Peakauswahl wurde mit XCMS in einer R-Umgebung40 durchgeführt. Darüber hinaus wurden erkannte Peaks mit dem CAMERA-Paket41 als Isotope, Addukte und Artefakte kommentiert. Die Optimierung der XCMS-Parameter erfolgte auf der Grundlage einer zuvor veröffentlichten Methode42. Die optimierten Parameter für die Peakauswahl und -ausrichtung sind in Tabelle S2 zu finden. Nach der Peakauswahl und der Gruppierung der Proben in einzelne Merkmale wurden die Merkmalsbereiche mithilfe der wiederholten Messung der gepoolten QC-Proben stapelweise korrigiert43.

Die Merkmalsanzahl wurde mithilfe einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) und des Welch-T-Tests bei zwei Stichproben basierend auf einer zuvor veröffentlichten Methode42 unter Verwendung von XCMS bestimmt und analysiert, wobei die Extraktion II, III und IV mit I, III mit III_B und IV mit IV_B verglichen wurde jeweils.

Basierend auf den Peakflächen der internen Standards (IS) und MoInt, die dem Bewertungsskript entnommen wurden, wurden Werte für Mittelwert, Standardabweichung und CV mit Excel berechnet und Diagramme mit GraphPad PRISM 9 erstellt. Darüber hinaus wurden basierend auf Manier und Meyer42, Die Peakflächen der internen Standards sowie des MoInt wurden mithilfe von ANOVA und Welchs Zwei-Proben-t-Test analysiert, wobei jede Extraktion mit Extraktion I verglichen wurde. Extraktion I wurde als Referenzmethode angesehen, wie sie zuvor erfolgreich für andere Metabolomics-Studien19 verwendet wurde sowie in Vorversuchen.

ANOVA wurde auf den gesamten generierten Datensatz angewendet, um signifikant unterschiedliche Moleküle oder Merkmale zwischen den sechs verschiedenen Probengruppen zu bestimmen, wobei die Bonferroni-Korrektur44 zur Korrektur falsch positiver Ergebnisse eingesetzt wurde. Um gruppenweise Unterschiede zwischen Extraktionsmethoden zu untersuchen, wurde eine Hauptkomponenten-Diskriminanzfunktionsanalyse (PC-DFA) unter Verwendung der signifikanten Merkmale durchgeführt. Vor der Hauptkomponentenanalyse wurde der Datensatz zentriert und die anschließende Diskriminanzanalyse verwendete diejenigen Komponenten, die das Kaiser-Kriterium mit mindestens zwei Komponenten erfüllten. Die Vorhersagequalität wurde mithilfe der Monte-Carlo-Kreuzvalidierung45 bestimmt.

Die Rohdatendateien werden mit der Studienkennung MTBLS6046 auf MetaboLights (https://www.ebi.ac.uk/metabolights/) hochgeladen. Das Auswertungsskript für die Datenvorverarbeitung und die statistische Analyse in R finden Sie auf Github (https://github.com/PhilSchip/zebrafish_extraction).

Das MoInt umfasste 59 Moleküle, hauptsächlich Wirtsmetaboliten, die in mykobakteriellen Infektionsmodellen unter Verwendung von Zebrafischen und anderen Arten als signifikant verändert befunden wurden, sowie Metaboliten aus vorläufigen Infektionsexperimenten, die vor dieser Studie als eine Form eines pseudozielgerichteten Ansatzes durchgeführt wurden. Metaboliten aus einer weiteren Studie, die nichts mit der Infektionsforschung zu tun hatte37, wurden aufgrund der Anpassung der Extraktionsmethode in dieser Arbeit einbezogen.

Basierend auf m/z und Retentionszeit wurde eine parallele Reaktionsüberwachung mit der gepoolten QC-Probe durchgeführt, um die MoInt mit einem Identifikationsgrad von 2 als mutmaßlich annotierte Verbindungen zu identifizieren, anstatt als unbekannte Verbindungen klassifiziert zu werden, wobei ein von Sumner46 vorgeschlagenes Klassifizierungssystem verwendet wurde. Datendateien wurden mit ProteoWizard39 in das mzXML-Format konvertiert und in NIST MS Search 2.3 importiert. Zur Identifizierung der Verbindungen wurden drei verschiedene Datenbanken verwendet: Human Metabolome Database (hmdb), NIST14 (Unterdatenbanken nist_msms und nist_msms2) und die Wiley METLIN Mass Spectral Database (Unterdatenbanken metlin_insilico und metlin_experimental). Die folgenden Parameter, basierend auf einer früheren Veröffentlichung36, wurden für die Bibliothekssuche verwendet: Spektrum-Suchtyp, Identität (MS/MS); Vorläuferion m/z, im Spektrum; Vorsuche, aus. Die MS/MS-Parameter waren wie folgt: Einstellungen: Vorläufertoleranz, ± 5 ppm; Produktion-Ionen-Toleranz: ± 10 ppm.

Um die biologische Relevanz der entdeckten interessierenden Moleküle zu bestimmen, wurde eine Signalweganalyse mit Version 5.0 von Metaboanalyt47 durchgeführt. HMDB-IDs jedes MoInts wurden als Identifikatoren verwendet, mit ihren entsprechenden KEGG-Identifikatoren verknüpft und anhand der Danio-Rerio-Pathway-Bibliothek von KEGG48,47,50 analysiert. Da 3-Ketocholesterin keine HMDB-ID und 3-Methoxytyrosin, Stearoylethanolamid und Dimethylarginin keine KEGG-ID haben, konnte 31 für diese Analyse verwendet werden. Die Analyse wurde unter Verwendung eines Streudiagramms als Visualisierungsmethode, eines hypergeometrischen Tests als Anreicherungsmethode, einer Relative-Betweenness-Zentralität für die Topologieanalyse sowie unter Verwendung aller Verbindungen der Signalwegbibliothek als Referenzmetabolom durchgeführt.

Die vier verschiedenen Extraktionsmethoden wurden zunächst anhand der Merkmalsanzahl analysiert. Während die Merkmalsanzahl als analysierter Qualitätsparameter bei gezielten Ansätzen von geringerer Relevanz ist, kann sie ein nützlicher Ersatz für ungezielte Metabolomik sein. Obwohl dies keinen Einfluss auf die Ergebnisse des pseudozielgerichteten Ansatzes hat, korreliert es besser mit der Abdeckung des gesamten Metaboloms und bietet somit eine höhere Chance, gewünschte, aber nicht gezielte Metaboliten zu erkennen. Wie in Abb. 3 dargestellt, ermöglichten die Extraktionen I und II die Erkennung von mehr Merkmalen im Vergleich zu den Zweiphasenmethoden III und IV. Aufgrund des Verlusts lipophiler Metaboliten während der Phasentrennung war diese Beobachtung zu erwarten und konnte mithilfe einer speziellen Methode für lipophile Substanzen am verworfenen lipophilen Extrakt umgangen werden. Die einzige Ausnahme bildete die Analyse auf der Phenyl-Hexyl-Säule im positiven Ionisationsmodus, bei der II, III und IV alle erhöht waren. Für Extraktion II und IV könnte die Ultraschallbehandlung und damit höhere Homogenisierung der Proben diesen Effekt erklären, was für Extraktion III nicht zutrifft. Bei den anderen Läufen konnte kein solcher Effekt der Ultraschallbehandlung beobachtet werden. Daher ist derzeit keine Erklärung möglich.

Anzahl der erkannten Features. Die statistische Auswertung erfolgte mittels einfaktorieller ANOVA und Welchs Zwei-Proben-t-Test, wobei jede Gruppe mit Extraktion I verglichen wurde. (A) Phenyl-Hexyl-Säule, positive Ionisierung. (B) Phenyl-Hexyl-Säule, negative Ionisierung. (C) HILIC-Säule, positive Ionisierung. (D) HILIC-Säule, negative Ionisierung. ns nicht signifikant; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. n = 5 für jede Stichprobengruppe.

Abgesehen von dieser Ausnahme zeigten die Extraktionen I und II eine sehr ähnliche Merkmalsanzahl, während sich die Methoden III und IV aufgrund der Polarität der Analyse unterschieden. Extraktion IV zeigte höhere Merkmalszahlen nach positiver Ionisierung (A und C) und Extraktion III nach negativer Ionisierung (B und D).

Im Allgemeinen ermöglichte der positive Ionisationsmodus die Erkennung von mehr Merkmalen als der negative Ionisationsmodus, mit etwa 2200–6000 Merkmalen im Vergleich zu etwa 600–1300 Merkmalen. Es wurde auch beobachtet, dass die Analyse nach Verwendung der HILIC-Säule weniger als die Hälfte der Merkmale zeigte als die Analyse nach Verwendung der Phenyl-Hexyl-Säule.

Die Verwendung einer mechanischen Vorbehandlung führte in allen durchgeführten Läufen zu einer deutlichen Erhöhung der Merkmalsanzahl (Abb. 4). Dies weist auf eine erfolgreiche Homogenisierung der Proben hin, was dazu führt, dass mehr abgebautes Larvengewebe und mehr Metaboliten für die Extraktion freigesetzt werden.

Basierend auf diesen Ergebnissen fehlten den Zwei-Phasen-Methoden Merkmale, was höchstwahrscheinlich auf die Trennung von hydrophilen und lipophilen Substanzen und die anschließende Entsorgung dieser lipophilen Substanzen zurückzuführen ist. Während die Extrakte selbst weniger störende Moleküle enthalten sollten, ist die Möglichkeit, dass relevante Merkmale fehlen, problematisch. Für den Einsatz der Bead-Homogenisierung zeigte sich das Gegenteil. Eine höhere Merkmalsanzahl, die in einigen Fällen gleich oder höher als bei den einphasigen Extraktionen war, führte zu einer besseren Abdeckung und einer höheren Wahrscheinlichkeit störender Moleküle.

Dennoch sind beide Ergebnisse mit Vorsicht zu genießen. Sowohl endogen abgeleitete Signale, die beispielsweise aus Isotopen, Adduktbildung oder Fragmentierung resultieren, als auch künstliche Signale aus Verunreinigungen, Rauschen oder Fehlern in der Datenverarbeitung51 können zu einer erheblichen Variation der gemessenen Merkmalsanzahl führen.

Allerdings führen in dieser Studie die geringe Variabilität in jeder Stichprobengruppe sowie die Kompensation zufälliger fehlerhafter Signale durch fünf wiederholte Extraktionen pro Gruppe zu einem hohen Vertrauen in diese Ergebnisse. Während diese Variationen immer noch eine Rolle bei den beobachteten Unterschieden spielen könnten, scheint es unwahrscheinlich, dass sie eine wesentliche Rolle spielen.

Diese Ergebnisse weisen auf Unterschiede zwischen den einzelnen Extraktionsprinzipien hin, während Methoden, die dasselbe Prinzip verwenden, erwartungsgemäß viel genauere Ergebnisse über alle Merkmale hinweg liefern. Ob diese Unterschiede für das zukünftige Infektionsmodell relevant sind oder sich nur auf Moleküle auswirken, die für die Untersuchung einer M. marinum-Infektion irrelevant sind, ist derzeit nicht bekannt. Um die Unterschiede und ihre Relevanz weiter zu bewerten, wurden in den folgenden Schritten interne Standards und MoInt analysiert, die auf der Grundlage des wissenschaftlichen Kontexts einer zukünftigen Anwendung des Extraktionsverfahrens für ein M. marinum-Infektionsmodell ausgewählt wurden.

Die verwendeten internen Standards können anhand ihrer Zugabe zu Beginn der Extraktion (Spitze 1), vor der Verdampfung (Spitze 2) oder während der Rekonstitution (Spitze 3) in drei separate Gruppen eingeteilt werden. Ihr Peakpicking-Erfolg in Abhängigkeit von der verwendeten Säule und Ionisierung sowie ihre Retentionszeit und m/z sind in Tabelle S1 zu finden. Auffällig ist die Tatsache, dass Tryptophan-d5 und Glucose-d7 mit der HILIC-Säule und dem negativen Ionisationsmodus nicht nachgewiesen wurden, was höchstwahrscheinlich auf sehr niedrige Intensitäten und im Fall von Glucose-d7 zusätzlich auf eine uncharakteristisch breite Peakform zurückzuführen ist. Die geringeren Intensitäten des IS nach negativer Ionisierung, insbesondere nach HILIC, konnten nicht umgangen werden. Die Peakform von Glucose-d7 nach HILIC deutete auf die Notwendigkeit einer Optimierung der Chromatographie hin, die im Rahmen dieser Studie aufgrund der geringen Relevanz von Sacchariden im MoInt sowie der ausreichenden Nachweisqualität nach RP nicht durchgeführt wurde Chromatographie.

Die Peakflächen jedes erkannten internen Standards wurden mithilfe der Extraktion I auf die mittlere Peakfläche normalisiert, die als Referenzstandard verwendet wurde, da es sich um eine bereits etablierte Methode handelte. Diese normalisierten Peakflächen sind in den Abbildungen zu finden. S2–S5. Die jeweiligen CV-Werte sind den Abbildungen zu entnehmen. S6–S9. Zusätzlich wurden die beiden Proben-t-Tests von Welch durchgeführt, bei denen die Peakflächen der Extraktionen II, III und IV mit Extraktion I verglichen wurden. Die daraus resultierenden signifikanten Unterschiede sind in den Tabellen S3–S6 zusammengefasst.

Die Peakflächen von Tryptophan-d5 waren bei den Extraktionsmethoden sehr ähnlich, mit Ausnahme der Extraktion IV, die in allen drei Analyseläufen eine deutliche Abnahme aufwies.

Glucose-d7 konnte nur mit der Phenyl-Hexyl-Säule und dem negativen Ionisationsmodus nachgewiesen werden, und es wurden sehr ähnliche Peakflächen beobachtet, mit Ausnahme eines Anstiegs bei Extraktion II.

Palmitinsäure-d31 zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen einphasigen und zweiphasigen Methoden. Höchstwahrscheinlich aufgrund seiner hohen Lipophilie als langkettige Fettsäure war die Gewinnung mit Zweiphasenmethoden nahezu nicht vorhanden, während die Extraktionen I und II gleichermaßen in der Lage waren, Palmitinsäure-d31 zu extrahieren.

Bei Verwendung negativer Ionisierung waren die Peakflächen der anderen sechs getesteten internen Standards der Spikes 2 und 3, abgesehen von den niedrigeren Peakflächen für Glibenclamid auf der HILIC-Säule für Extraktion II, III und IV, zwischen den Extraktionen sehr ähnlich. Bei der positiven Ionisierung wurde jedoch der Trend für Glibenclamid und Trimipramin-d3 auf der Phenyl-Hexyl-Säule und für den gleichen IS sowie für Bisoprolol-d5 und Telmisartan-d7 beobachtet, wobei Extraktion IV die niedrigsten beobachteten Peakflächen aufwies. Diese IS wurden kurz vor der Verdunstung und Rekonstitution hinzugefügt, diese Unterschiede können erst ab diesem Zeitpunkt entstehen. Neben Störungen durch andere Moleküle könnte auch die längere Dauer der Vakuumverdampfung ein Faktor für den Intensitätsverlust sein. Andererseits wurde der gleiche Effekt für Bisoprolol-d5 und Telmisartan-d7 beobachtet, die in der Spike-Lösung 3 enthalten waren und der Rekonstitutionslösung zugesetzt wurden, jedoch nur vor der HILIC-basierten Analyse. Daher war eine Wechselwirkung dieser IS mit anderen Molekülen während des LC-Laufs oder eine Adhäsion an den verwendeten nicht silanisierten Braunglasfläschchen wahrscheinlicher.

Bei den Lebensläufen lag die Mehrheit zwischen 5 und 20 %. Ausnahmen sind Palmitinsäure-d31 für Zweiphasenextraktionen aufgrund der sehr geringen Peakflächen, Glucose-d7 für Extraktion IV sowie Glibenclamid auf der HILIC-Säule und Bisoprolol-d5 bei Extraktion II.

Insgesamt zeigten alle Extraktionsmethoden relativ niedrige CV-Werte, wobei Extraktion II die schlechteste Präzision aufwies und Extraktion III aufgrund der Gewinnung von Tryptophan-d5 vor Extraktion IV bevorzugt wurde.

Außer einer signifikanten Zunahme der Furosemid-Peakflächen (negative Ionisierung, Phenyl-Hexyl-Säule) konnten keine signifikanten Veränderungen der Peakflächen des IS beobachtet werden. Die mechanische Vorbehandlung führte insgesamt zu einem Anstieg der CVs für Tryptophan-d5, mit Ausnahme der Extraktion IV_B auf der HILIC-Säule (positive Ionisierung), die eine Reduzierung um ~ 2 %-Punkte zeigte, während Glucose-d7 mit der Methode einen Anstieg zeigte III und eine Verringerung nach Methode IV in der gleichen Größenordnung.

Um die Unterschiede zwischen Extraktionsmethoden, die für das gewählte Analyseproblem relevant sein könnten, weiter zu bewerten, wurde eine umfassende Bibliothek sogenannter MoInt verwendet. Insgesamt wurden 59 MoInt für die Bewertung ausgewählt, basierend auf Literatur und vorläufigen internen Experimenten, die in Tabelle S7 zu finden sind. Nach der Erkennung und manuellen Auswertung der resultierenden Peaks blieben 34 bzw. 16 Moleküle dieser Liste übrig, wobei positive bzw. negative Ionisierung verwendet wurde. Für quantitative und zielgerichtete Ansätze werden in der Regel vorab Kalibrierungsbereiche getestet, um die Analyse von Zielmolekülen im dynamischen Bereich einer Konzentrations-Wirkungs-Kurve sicherzustellen. Aufgrund der Vielzahl möglicher und unbekannter Ziele ist dieser Ansatz für ungezielte Ansätze nicht durchführbar. Diese Studie und die weiteren geplanten Infektionsstudien verwenden einen qualitativen Ansatz, bei dem nur relative Mengen des MoInt zwischen verschiedenen Probengruppen verglichen werden, ohne die Konzentration der Zielmoleküle zu quantifizieren. Dennoch kann die Detektorsättigung auch bei ungezielten und qualitativen Studien ein Problem darstellen. Um diesen Effekt im Kontext der aktuellen Studie zu bewerten, wurden die Peakformen und -intensitäten aller MoInt und IS manuell mit der TF Xcalibur-Software analysiert. Die Signale wurden auf Anzeichen einer Sättigung wie unregelmäßige, abgeflachte Peakformen oder besonders hohe Signalintensitäten untersucht. In den Daten dieser Studie wurde keiner dieser Effekte beobachtet. Die resultierenden Daten sollten daher in Bezug auf die analysierten MoInt- und IS-Werte als robust angesehen werden, wobei anerkannt werden muss, dass für zukünftige ungezielte metabolomische Studien Sättigungseffekte durch zusätzliche Verdünnungsexperimente und Experimente mit höheren Substratmengen (in diesem Fall Zebrafisch) ausgeschlossen werden sollten Larven).

Die Liste dieser erfolgreich erkannten MoInt, ihre Verbindungsuntergruppe sowie ihre Erkennung auf jeder Spalte, Einschlussparameter und Identifikationsstatus basierend auf Spektren, die in nachfolgenden PRM-Läufen der gepoolten QC-Probe generiert wurden, finden Sie in Tabelle 1 für positiver Ionisationsmodus und Tabelle 2 für den negativen Ionisationsmodus.

Wie die Peakflächen der internen Standards (siehe Abschn. 3.1.2) wurden die Peakflächen jedes detektierten MoInt auf die mittlere Peakfläche der Extraktion I normiert und die Mittelwerte für jede Extraktion sowie deren Standardabweichungen können ermittelt werden gefunden in Abb. S10–S13. Die Ergebnisse des Zwei-Stichproben-T-Tests von Welch, bei dem die Extraktionen II, III und IV mit Extraktion I verglichen werden, sind in den Tabellen S8–S11 zu finden.

In allen vier Analyseläufen wurde das meiste MoInt mit Peakflächen nachgewiesen, die in etwa denen von Extraktion I entsprachen, insbesondere bei Extraktion II, der Methode, die der Extraktion I am nächsten kommt. Die Verwendung von Zweiphasen-Extraktionsmethoden führte zu einer deutlichen Reduzierung der Peakflächen für einige MoInt, insbesondere 3-Ketocholesterin, N-Palmitoyl-d-Sphingosin und Inosinsäure. Im Gegensatz dazu wurde ein breites Spektrum an Molekülen, insbesondere Aminosäuren, deutlich erhöht. Während die geringere Ausbeute durch die Lipophilie des betroffenen MoInt erklärt werden kann, könnten die erhöhten Peakflächen für Aminosäuren auf mehrere Faktoren zurückzuführen sein, z. B. eine insgesamt höhere Ausbeute, eine höhere Anzahl von Störsignalen bei ähnlichen m/z- und Retentionszeitwerten oder geringere Mengen an Molekülen, die die Ionisierung des MoInt beeinträchtigen.

Insbesondere eine höhere Anzahl störender Moleküle könnte bei Verwendung der Phenyl-Hexyl-Säule eine wichtige Rolle spielen, da die meisten Aminosäuren sehr früh innerhalb der ersten 60 s eluieren.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass zweiphasige Extraktionen den Vorteil einer höheren MoInt-Ausbeute zu haben schienen, wobei beide Methoden III und IV sehr ähnliche Ergebnisse zeigten. Was die einphasige Extraktion betrifft, scheint Extraktion I im Hinblick auf die Wiederherstellung von Merkmalen am vielversprechendsten zu sein. Die Zusammenfassung dieser Ergebnisse für alle MoInt für jede Extraktion (Abb. 5) ergab, dass die Einphasenmethoden insgesamt viel geringere Peakflächen aufwiesen, wobei Extraktion II die geringste Ausbeute zeigte, außer auf der Phenyl-Hexyl-Säule mit negativer Ionisierung. Die Extraktionen III und IV zeigten sehr ähnliche Ergebnisse. Die Betrachtung der Standardabweichungsextraktion I zeigte die höchste Präzision, während Extraktion II durchweg eine geringere Präzision aufwies, und beide Zweiphasenmethoden zeigten die höchsten Standardabweichungen und die niedrigste Präzision, mit Ausnahme der Extraktion II auf der Phenyl-Hexyl-Säule und der positiven Ionisierung.

Mittelwert der normalisierten Peakflächen jedes Extraktionsverfahrens und ihre jeweilige Standardabweichung. n = 5 für jede Stichprobengruppe. (A) Phenyl-Hexyl-Säule, positive Ionisierung. (B) Phenyl-Hexyl-Säule, negative Ionisierung. (C) HILIC-Säule, positive Ionisierung. (D) HILIC-Säule, negative Ionisierung.

Um die Präzision jedes einzelnen MoInt zu veranschaulichen, sind in den Abbildungen die jeweiligen CV-Werte dargestellt. S14–S17. Die meisten Lebensläufe lagen zwischen 5 und 25 %. Die Verwendung positiver Ionisierung führt im Vergleich zur negativen Ionisierung zu präziseren Ergebnissen, zumindest teilweise aufgrund der insgesamt geringeren Intensitäten für die meisten Analyten in den negativen Läufen, insbesondere für solche, die sowohl durch positive als auch negative Ionisierung nachgewiesen werden. Extraktion II zeigte im Durchschnitt die höchsten CV-Werte und die meisten Moleküle mit sehr großen Abweichungen, während die Extraktionen III und IV im Vergleich zu Extraktion I größtenteils gleiche oder leicht höhere CV-Werte aufwiesen. Einige der höheren CV-Werte wurden darüber hinaus durch die zuvor genannten Faktoren beeinflusst geringere Rückgewinnung lipophiler Moleküle. Extraktion I zeigte die genauesten Ergebnisse für einphasige Extraktionen, während Extraktion III einen etwas niedrigeren CV für negative Ionisierung und Extraktion IV für positive Ionisierung aufwies.

Die Peakflächen der Extraktionen III und IV im Vergleich zu ihren Gegenstücken mit zusätzlicher Vorbehandlung (Extraktionen III_B und IV_B) sind in den Abbildungen zu finden. S18–S21 des Zusatzmaterials. Zusammengefasst in Abb. 6 zeigten beide Extraktionen mit Vorbehandlung im Durchschnitt eine Zunahme der MoInt-Peakflächen. Extraktion III_B zeigte im Vergleich zu IV_B höhere Peakflächen für negative Ionisierung und ähnliche oder etwas niedrigere Peakflächen für positive Ionisierung. Die höheren Peakbereiche gingen mit höheren oder ungefähr gleichen Standardabweichungen einher. Die Lebensläufe der einzelnen MoInt zeigten keine eindeutigen Tendenzen (Abb. S22–S25). Extraktion IV_B führte zu höheren CVs als III_B, und im Durchschnitt waren die CVs zwischen den jeweiligen Extraktionen mit oder ohne mechanische Vorbehandlung ähnlich. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Perlenhomogenisierung die Rückgewinnung von MoInt steigerte, während das genaue Gleiche mit seinem Gegenstück ohne zusätzliche Homogenisierung erhalten blieb.

Von den 35 in dieser Studie entdeckten MoInt konnten 31 in der KEGG-Datenbank gefunden werden, während die MoInt Ketocholesterin, 3-Methoxytyrosin, Stearoylethanolamid und Dimethylarginin höchstwahrscheinlich aufgrund der Tatsache, dass es sich um recht unerforschte Metaboliten handelt, fehlten. 3-Ketocholesterin und Stearoylethanolamid stammen aus vorläufigen internen Experimenten und werden daher nur vorläufig mit einer Mycobacterium marinum-Infektion bei ZF in Verbindung gebracht, während 3-Methoxytyrosin und Dimethylarginin in einer anderen Studie mit einer Mycobacterium-Marinum-Infektion bei ZF in Verbindung gebracht wurden20.

Die Zusammenfassung der Signalweganalyse für die MoInts ist in Abb. 7 zu finden. Insgesamt wurden 33 Signalwege gefunden, von denen die meisten mit dem Metabolismus spezifischer Moleküle zusammenhängen, z. B. dem Metabolismus von Tryptophan, Biotin oder Phenylalanin. Eine Übersicht aller Pfade finden Sie in Tabelle S12. Von diesen 33 Pfaden zeigten neun einen p-Wert von 0,01 oder weniger, was auf robuste Korrelationen zwischen MoInt und den Pfaden hinweist. Die Aminoacyl-tRNA-Biosynthese zeigte die höchste Menge an korreliertem MoInt. Dies beruht ausschließlich auf der Tatsache, dass die Aminosäuregruppe die größte Gruppe der nachgewiesenen MoInt darstellt und daher als Vorläufer der Aminoacyl-tRNA-Biosynthese Teil dieses Weges ist. Allerdings war der entsprechende Impact Score mit 0,00 sehr niedrig. Viel relevanter sind Pfade, die einen hohen Impact-Wert und niedrige p-Werte kombinieren. Solche Wege waren die Arginin-Biosynthese und der Lysin-Abbau, die nach der tRNA-Biosynthese die niedrigsten p-Werte und einen mäßigen Einfluss zeigten, während die Biosynthese von Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan sowie der Metabolismus von Alanin, Aspartat und Glutamat den größten Einfluss zeigten Werte und sind daher höchstwahrscheinlich mit anderen Stoffwechselwegen und dem Stoffwechsel als Ganzem verbunden und relevant.

Zusammenfassung der Pfadanalyse aller erkannten MoInt, wobei die relevantesten Pfade anhand ihrer Auswirkungen und angepassten p-Werte identifiziert werden. Die Auswirkung auf den Pfad wurde als eine Kombination aus Zentralität und Anreicherung des Pfads berechnet, wobei der Auswirkungswert positiv mit der relativen Bedeutung eines Pfads korrelierte. Die Farben der Kreise geben die Bedeutung an (von Weiß zu Rot ansteigend) und die Kreisgrößen die Auswirkung auf den Pfad. Die Ergebnisse wurden mit Metaboanalyst Version 5.0 generiert.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das in dieser Studie entdeckte und analysierte MoInt mit mehreren Signalwegen mit unterschiedlichen Auswirkungen in Verbindung gebracht werden könnte, und in Kombination mit nachgewiesenen Korrelationen mit mykobakteriellen Infektionen für die meisten von ihnen könnte das ausgewählte MoInt für zukünftige Infektionsstudien nützlich sein, die eine Vielzahl verschiedener Aspekte abdecken Stoffwechselwege.

Die gesamten bei jedem Extraktionsverfahren erfassten Metabolome wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA analysiert. Merkmale, die einen signifikanten Unterschied zwischen zwei beliebigen Gruppen zeigten, wurden für die multivariate Statistik beibehalten. Mit 3016 und 638 deutlich unterschiedlichen Merkmalen nach der Analyse mit der Phenyl-Hexyl-Säule sowie 713 und 202 nach der Analyse mit der HILIC-Säule für positive bzw. negative Ionisierung. Vergleicht man diese Zahlen mit der zuvor diskutierten Gesamtzahl der Merkmale, waren etwa 50 % aller Merkmale in der Phenyl-Hexyl-Spalte und etwa 30 % in der HILIC-Spalte signifikant. Dies weist darauf hin, dass die Phenyl-Hexyl-Säule stärker von Änderungen am Extraktionsverfahren betroffen ist. Bei diesem Phänomen könnten zwei mögliche Effekte eine Rolle spielen. Erstens, unterschiedliche Nachweisbarkeit von Molekülen, basierend auf der Trennung auf den verschiedenen Säulen, was dazu führt, dass mehr Moleküle, die von der Extraktion nicht betroffen sind, auf der HILIC-Säule nachgewiesen werden oder umgekehrt. Zweitens Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Molekülen, z. B. Löschung der Ionisierung oder Störsignale, die in der ersten Minute auf der Phenyl-Hexyl-Säule besonders relevant wären. Die meisten Aminosäuren im MoInt sowie viele erkannte Moleküle wurden in diesem Fenster nachgewiesen, was die Möglichkeit dieser Wechselwirkungen erhöht und die Variabilität einer Vielzahl von Molekülen erhöht. Während eine ähnliche Anzahl von Molekülen direkt vom Extraktionsprozess betroffen sein könnte, könnte ihre gemeinsame Elution auf der Phenyl-Hexyl-Säule ihre Wirkung auf das erkannte Metabolom verstärken.

Der folgende PC-DFA in Abb. 8 und 9 zeigten eine gute Trennung zwischen einphasigen Extraktionen (I und II), zweiphasigen Extraktionen (III und IV) und zweiphasigen Extraktionen mit mechanischer Vorbehandlung (III_B und IV_B). Die einzige Ausnahme wurde für die Phenyl-Hexyl-Säule und die positive Ionisierung gefunden, wobei III_B und IV sehr ähnlich sind. Dies könnte auf einen ähnlichen Effekt der Perlenhomogenisierung von III_B und der Ultraschallbehandlung von IV hinweisen, dies wird jedoch durch die anderen Ergebnisse nicht gestützt.

PC-DFA unter Verwendung signifikanter Merkmale, die durch eine einfaktorielle ANOVA identifiziert wurden. (A) Phenyl-Hexyl-Säule, positiver Ionisierungsmodus. (B) Phenyl-Hexyl-Säule, negativer Ionisationsmodus. Die Anzahl der verwendeten Hauptkomponenten, die Vorhersagegenauigkeit und Cohens κ werden angegeben. n = 5 für jede Stichprobengruppe. Diskriminanzfunktionen (DF1 und DF2) zur Maximierung des Abstands zwischen den Klassen und zur Minimierung des Abstands innerhalb der Klassen wurden als x- bzw. y-Achse aufgetragen. Die Hinzufügung der Perlenhomogenisierung wurde mit „_B“ bezeichnet.

PC-DFA unter Verwendung signifikanter Merkmale, die durch eine einfaktorielle ANOVA identifiziert wurden. (A) HILIC-Säule, positive Ionisierung. (B) HILIC-Säule, negative Ionisierung. Die Anzahl der verwendeten Hauptkomponenten, die Vorhersagegenauigkeit und Cohens κ werden angegeben. n = 5 für jede Stichprobengruppe. Diskriminanzfunktionen (DF1 und DF2) zur Maximierung des Abstands zwischen den Klassen und zur Minimierung des Abstands innerhalb der Klassen wurden als x- bzw. y-Achse aufgetragen. Die Hinzufügung der Perlenhomogenisierung wurde mit „_B“ bezeichnet.

Während Extraktion I und II sowie III_B und IV_B in allen Läufen klar getrennt waren, waren Extraktion III und IV für die HILIC-Säule nicht klar getrennt, was auf eine sehr ähnliche Abdeckung des Metaboloms und somit auf keinen signifikanten Effekt der Extraktionsunterschiede zwischen ihnen hinweist die beiden Methoden. Durch das Hinzufügen einer mechanischen Vorbehandlung wird auch die Trennung erhöht, sodass kein konsistenter Effekt beobachtet werden konnte.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass alle sechs Extraktionen, abgesehen von der zuvor erwähnten Ausnahme, eine unterschiedliche Abdeckung des gesamten Metaboloms zeigten, was darauf hindeutet, dass die Unterschiede in den Extraktionsverfahren ein unterschiedliches Gewicht haben. Phasentrennung und Perlenhomogenisierung schienen die Extraktion viel drastischer zu verändern als Variationen anderer Faktoren wie Extraktionslösungsmittel, Inkubationszeit oder Hinzufügung von Ultraschall.

Zwischen den getesteten Untergruppen konnten mehrere Unterschiede beobachtet werden (Tabelle 3). Zweiphasenextraktionen ohne Perlenhomogenisierung zeigten die niedrigste Merkmalsanzahl, wobei die beiden anderen Gruppen ähnliche Zählungen aufwiesen. Extraktion II hatte in dieser Studie die niedrigste Ausbeute, gefolgt von Extraktion I. Beide Zweiphasenextraktionen hatten höhere Ausbeutungsraten, die durch die Perlenhomogenisierung noch erhöht wurden. Die niedrigsten CV-Werte und damit die besten Präzisionen wurden für Extraktion I gefunden, wobei beide Zweiphasenextraktionen im Durchschnitt etwas höhere CVs aufwiesen, die nach der Bead-Homogenisierung noch einmal anstiegen. In dieser Studie wurden verschiedene Extraktionen verglichen. Einphasige Extraktionen führten insgesamt zur Erkennung von mehr Merkmalen und die Merkmalsbereiche von MoInt waren in den meisten Fällen geringer als bei den Extraktionen III und IV, insbesondere im Hinblick auf Aminosäuren. Nur wenige MoInt sowie Palmitinsäure-d31 wurden reduziert, höchstwahrscheinlich aufgrund ihrer Lipophilie und der daraus resultierenden Entfernung in der lipophilen Chloroformverteilung bei Zweiphasenextraktionen. Die CVs von MoInt waren bei einphasigen Methoden, insbesondere Extraktion I, niedriger, was auf eine insgesamt bessere Präzision und Reproduzierbarkeit hinweist. Eine zusätzliche Homogenisierung der Larven mit Glasperlen erhöhte die Merkmalsanzahl und die Ausbeute von MoInt, während die Präzision leicht abnahm. Daher könnte die Bead-Homogenisierung eine mögliche Optimierung in der Zukunft sein, wenn die Vorteile einer höheren Ausbeute und Merkmalsanzahl die ungenaueren Ergebnisse überwiegen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Extraktion I der Extraktion II vorzuziehen ist, da die Peakflächen von MoInt insgesamt höher sind, die CVs dieser Peakflächen niedriger sind und die Anzahl der Merkmale ähnlich ist, sowie der experimentelle Prozess einfacher ist. Extraktion III und IV zeigten ähnliche Peakflächen und CVs für MoInt, Extraktion III zeigte jedoch eine höhere Merkmalsanzahl bei Verwendung negativer Ionisierung, einen einfacheren experimentellen Prozess und eine höhere Peakfläche für Tryptophan-d5.

Weitere Experimente mit dem Infektionsmodell selbst müssen durchgeführt werden, und die beiden Methoden I und III, die in dieser Studie die besten Ergebnisse zeigen, müssen detaillierter verglichen werden. Um einen robusteren Datensatz zu erhalten und die Anzahl der verwendeten Proben zu erhöhen, könnten wiederholte Experimente sowie die mögliche Einbeziehung anderer interner Standards und zusätzlicher MoInt hinzugefügt werden.

Nicht alle während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Daten sind öffentlich verfügbar, können aber auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor angefordert werden.

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Der Autor dankt Felix Deschner, Verena Quallaku, Armin A. Weber, Matthias J. Richter, Tanja M. Gampfer, Cathy M. Jacobs, Juel M. Schaar und Carsten Schröder für ihre Unterstützung und/oder hilfreiche Diskussion und das HIPS -UdS-TANDEM-Initiative um Unterstützung.

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Abteilung für Experimentelle und Klinische Toxikologie, Zentrum für Molekulare Signalgebung (PZMS), Institut für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie, Universität des Saarlandes, 66421, Homburg, Deutschland

Philip Schippers, Lea Wagmann, Selina Hemmer, Sascha K. Manier & Markus R. Meyer

Helmholtz-Institut für Pharmazeutische Forschung Saarland (HIPS), Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung (HZI), Universität des Saarlandes, Saarbrücken, Deutschland

Philip Schippers, Sari Rasheed, You Me Park, Timo Risch, Rolf Müller und Jennifer Herrmann

Deutsches Zentrum für Infektionsforschung (DZIF), Partnerstandort Hannover, Braunschweig, Deutschland

Sari Rasheed, Timo Risch, Rolf Müller und Jennifer Herrmann

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PS, SR, SH, SKM, RM, JH, MRM haben das Experiment entworfen; PS, SR, YMP, TR führten die Experimente durch; PS, SR, LW, SH, SKM, JH, MRM analysierten und interpretierten die Daten; PS, RM, JH, MRM haben das Manuskript geschrieben und bearbeitet; PS hat die Zahlen vorbereitet; LW, SH, SKM überprüften das Manuskript.

Korrespondenz mit Markus R. Meyer.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Schippers, P., Rasheed, S., Park, YM et al. Evaluierung von Extraktionsmethoden für ungezielte metabolomische Studien für zukünftige Anwendungen in Zebrafischlarven-Infektionsmodellen. Sci Rep 13, 7489 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34593-y

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Eingegangen: 06. Februar 2023

Angenommen: 04. Mai 2023

Veröffentlicht: 09. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34593-y

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