Anwendung immunverstärkter Organoide bei der Modellierung der personalisierten Merkelzellkarzinomforschung

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 13865 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Das Merkelzellkarzinom (MCC) ist ein seltener neuroendokriner Hautkrebs mit einer Inzidenz von weniger als 1/100.000, niedrigen Überlebensraten und unterschiedlichem Ansprechen auf Chemotherapie oder Immuntherapie. Hier untersuchen wir die Anwendung von Tumororganoiden (PTOs) von Patienten bei der Modellierung personalisierter Forschung zu dieser seltenen bösartigen Erkrankung. Unsortierte und nicht expandierte MCC-Tumorzellen wurden aus chirurgischen Proben isoliert und zusammen mit dem Blut und Lymphknotengewebe des Patienten in einem ECM-basierten Hydrogel suspendiert, um immunverstärkte Organoide (iPTOs) zu erzeugen. Organoide wurden mit Chemotherapie- oder Immuntherapeutika behandelt und die Wirksamkeit wurde anhand der Lebensfähigkeit nach der Behandlung bestimmt. Von Dezember 2018 bis Januar 2022 wurden neun Proben von sieben Patienten rekrutiert. Die Etablierungsrate betrug 88,8 % (8/9) für PTOs und 77,8 % (7/9) für iPTOs. Die Histologie an passenden Patientengeweben und PTOs zeigte die Expression von MCC-Markern. Bei 4/6 (66,6 %) Proben zeigte sich ein Ansprechen auf die Chemotherapie, wobei Cisplatin und Doxorubicin die wirksamsten Wirkstoffe waren (4/6 PTO-Sets), während die Immuntherapie in den getesteten iPTO-Sets nicht wirksam war. Vier Proben von zwei Patienten zeigten eine Resistenz gegen Pembrolizumab, was mit dem Ansprechen des entsprechenden Patienten auf die Behandlung korrelierte. Die routinemäßige Etablierung und Immunstärkung von MCC-PTOs ist direkt aus resezierten chirurgischen Proben möglich, was eine personalisierte Forschung und Erforschung von Behandlungsschemata im präklinischen Umfeld ermöglicht.

Das Merkelzellkarzinom (MCC) ist ein seltener und aggressiver neuroendokriner Hautkrebs mit einer geschätzten jährlichen Inzidenz von 0,7 Fällen pro 1.000.0001 und schlechteren Überlebensergebnissen als Melanome. Während frühe Untersuchungen darauf hinwiesen, dass MCC aus der Neuralleiste entstanden ist, deuten neuere Erkenntnisse auf epidermale Vorläufer hin2,3. Die maligne Transformation ist bei etwa 60–80 % der MCC-Krebserkrankungen eine Folge einer Infektion mit dem Merkelzell-Polyomavirus (MCPyV), während sie bei einer kleineren Untergruppe von Patienten mit UV-Exposition verbunden ist4, wobei die beiden Ereignisse synergistisch die Mutationslast und die Neoantigenität erhöhen von MCC-Tumoren.

Die meisten Patienten mit MCC weisen eine lokoregionäre Erkrankung auf, die eine chirurgische Resektion gefolgt von einer adjuvanten Bestrahlung bei ausgewählten Patienten erfordert4. Bei Patienten mit metastasierender Erkrankung gibt es nur begrenzte Möglichkeiten, während die Seltenheit von MCC es schwierig macht, Patienten für Vergleichsstudien mit neuen Wirkstoffen zu gewinnen5,6. Es besteht ein schnell wachsendes Interesse an Checkpoint-Inhibitoren sowie an der Entwicklung eines MCPyV-Impfstoffs7,8,9. Doch trotz vielversprechender Ergebnisse mit der Immuntherapie, die 2017 zur FDA-Zulassung führten, bleibt die erworbene Tumorresistenz wie bei vielen anderen Krebsarten ein ernstes Problem, zusammen mit der mit der Immuntherapie verbundenen Toxizität10. Daher ist die Vorhersage eines potenziellen Behandlungsversagens wichtig, um behandlungsbedingte Nebenwirkungen in Fällen zu vermeiden, in denen kein Überlebensvorteil zu erwarten ist.

Aufgrund der geringen Inzidenz von MCC sind alternative Optionen zu klinischen Studien erforderlich, um die Wirksamkeit der präklinischen Behandlung zu bestimmen. Wir haben zuvor über eine erfolgreiche Organoidmodellierung mehrerer Tumorarten berichtet, darunter Mesotheliome, Lungentumoren, Blinddarmtumoren, Melanome, Sarkome und kolorektale Primärtumoren11,12,13,14,15,16. Wichtig ist, dass einige dieser Studien seltene Tumorsubtypen analysierten, bei denen in der klinischen Behandlung in den letzten Jahrzehnten kaum Fortschritte erzielt wurden. Diese Organoide wurden erfolgreich in einem streng kontrollierten Hydrogelsystem aus Kollagen und Hyaluronsäure hergestellt, wodurch die Notwendigkeit eines xenogenen Basalmembranextrakts für die Kultur entfällt. Die PTOs waren innerhalb einer Woche nach der Herstellung für präklinische Tests bereit und lieferten Behandlungsdaten innerhalb eines Zeitrahmens, der für die potenzielle Unterstützung und Information klinischer Entscheidungen relevant war. Diese Studien konnten das Nutzenpotenzial in Präzisionsmedizinanwendungen sowohl für zugelassene als auch für Prüftherapien nachweisen12,15,17,18.

Hier zeigen wir die Machbarkeit dieser Ansätze bei der Entwicklung von PTOs, um eine personalisierte klinische Forschungsplattform für MCC auf der Ebene des einzelnen Patienten zu schaffen. Wir demonstrieren die Biofabrikation von MCC-PTOs aus reseziertem Patientengewebe und zeigen Ähnlichkeit bei den Gewebemarkern für die Tumoren. Wir haben den Einsatz sowohl von Chemotherapie-Prüfschemata als auch von zugelassenen Immuntherapie-Behandlungen auf vergleichende Wirksamkeit analysiert. Schließlich konnten wir die Ergebnisse zeitlich unterschiedlicher Resektionen desselben Patienten mit ihrem klinischen Ergebnis vergleichen. Wir glauben, dass die präsentierten Daten den Nutzen von PTOs in der MCC-Forschung und in Zukunft möglicherweise als präklinisches Begleitinstrument bei seltenen bösartigen Erkrankungen verdeutlichen.

Im Studienzeitraum von Dezember 2018 bis Januar 2022 wurden neun Tumorproben von sieben Patienten entnommen (Tabelle 1). Acht der Tumoren lieferten genügend Zellen, um Organoide für das Therapiescreening zu produzieren. Ein Patient unterzog sich während der Immuntherapie einer zweiten und dritten Operation wegen einer wiederkehrenden Erkrankung, und beide weiteren Proben wurden zu Organoiden verarbeitet. Darüber hinaus lieferten sieben Gewebe ausreichend Tumorzellen mit separaten Proben für Lymphozyten für parallele Immuntherapietests, wobei sechs Sätze Patientenblut und ein Satz einen resezierten Lymphknoten verwendeten (Abb. 1). Nach der Biofabrikation wurden die PTOs 7 Tage lang kultiviert und drei Tage lang Drogentests unterzogen. Insgesamt lagen die Ergebnisse des Arzneimittelscreenings für alle Proben innerhalb von 10 Tagen vor, sodass eine Zellexpansion nicht erforderlich war und innerhalb eines klinisch relevanten Zeitrahmens patientenspezifische Daten generiert wurden.

Flussdiagramm der Herstellung von Merkelzellkarzinom-Organoiden. Tumorzellen wurden aus verdautem Tumorgewebe isoliert und zu PTOs verarbeitet, während Immunzellen aus Patientenblut oder Lymphgewebe isoliert und mit Tumorzellen kombiniert wurden, um iPTOs zu erzeugen. Diese Organoide wurden eine Woche lang kultiviert, anschließend charakterisiert und auf therapeutische Wirksamkeit untersucht. Erstellt mit BioRender.com.

Die Erhaltung primärer Tumorzellen in Organoidkultur ist für eine genaue Gewebedarstellung und die richtige Reaktion auf therapeutische Interventionen von wesentlicher Bedeutung. Die vergleichende Färbung von reseziertem Gewebe und PTOs zeigte ein hohes Maß an Übereinstimmung bei der Identifizierung von Flecken (Abb. 2 und ergänzende Abb. S1). Eine ähnliche Zellmorphologie zeigt sich in passendem Patientengewebe und PTOs, während iPTOs Immunzellpopulationen aufwiesen (Abb. 2a, b, i und ii). Positive Expressionen von Pan-Cytokeratin und CK20 werden häufig zur Unterscheidung zwischen MCC und anderen Tumorursprüngen verwendet, einschließlich Melanomen und anderen metastasierten neuroendokrinen Tumoren (Abb. 2a, b, iii und iv)19. MCC hat seinen Namen von der sensorischen Neuronenlinie der Merkelzellen, von der es abgeleitet sein könnte, und zeigt auch eine positive Expression neuronaler Marker, einschließlich Synaptophysin, Neurofilament und Chromogranin20. Es wurde auch gezeigt, dass diese Marker eine hohe Korrelation zwischen passendem PTO und Gewebe aufweisen (Abb. 2a, b, v – vii). Darüber hinaus wird vermutet, dass das Merkelzell-Polyomavirus (MCPyV) eine bedeutende Rolle bei der Entwicklung der Krankheit spielt; in bis zu 80 % der Patientenfälle ist ein Virus vorhanden. Wir beobachteten eine positive Expression bei 5 von 7 (71 %) Patiententumoren (Abb. 2a, b, viii). Die IHC-Färbung von PTOs und Gewebe zeigte eine fehlende Expression von CD45 und S100, wodurch alternative Diagnosen ausgeschlossen wurden, die MCC morphologisch simulieren, einschließlich Lymphom bzw. Melanom (ergänzende Abbildung S2).

Immunhistochemie von passendem Patientengewebe (Bx) und Merkelzellkarzinom-PTO-Set (a) MCC5 und (b) MCC7. Der Vergleich von Gewebe und PTOs zeigt eine hohe Übereinstimmung der Identifikationsmarker, einschließlich (i) Zellmorphologie (H&E), (ii) iPTO-Zellmorphologie (H&E), (iii) Pan-Cytokeratin (Pan CK), (iv) Cytokeratin 20 (CK20), (v) Neurofilament (NFH), (vi) Chromogranin A (ChgA), (vii) Synaptophysin (SYP und (viii) Merkelzell-Polyomavirus (MCPyV). Darüber hinaus zeigten die Sätze MCC5 (a) und MCC7 (b) eine variable Expression von Marker im Zusammenhang mit der Krankheitsidentifizierung und möglichen Ergebnissen, einschließlich MCPyV. Alle Bilder wurden mit 40-facher Vergrößerung und einem Maßstab von 20 μM aufgenommen.

Um die Machbarkeit von PTOs im therapeutischen Screening zu bestätigen, wurden PTOs mit einer Reihe von Chemotherapien behandelt, die derzeit im klinischen Umfeld eingesetzt werden (Abb. 3, 4). Insgesamt variierte das Ansprechen auf die Therapie je nach PTO und Behandlung, wobei die wirksamste Therapie eine Kombination aus Cisplatin und Doxorubicin war (4/6, 66 %). Die Analyse von Kombinationstherapien kann möglicherweise dazu beitragen, die wirksamen Komponenten in jeder Therapie für jeden einzelnen Patienten zu bestimmen oder neue Therapieprotokolle zu entwerfen. Beispielsweise zeigte das PTO-Set MCC2 eine signifikante Reaktion auf die Kombination von Cisplatin mit Doxorubicin. Eine weitere Analyse der individuellen Reaktion zeigt jedoch, dass die Reaktion nicht synergistisch ist, sondern hauptsächlich auf die Zytotoxizität von Doxorubicin zurückzuführen ist (Abb. 3, 4ai–iii). Im Gegensatz dazu verwendete das PTO-Set MCC5 die gleiche Kombination, aber die individuelle Reaktion legt nahe, dass Cisplatin für die Wirksamkeit des Regimes verantwortlich ist (Abb. 3, 4i–iii).

Das Chemotherapie-Screening von PTO zeigt eine intertumorale Heterogenität beim Ansprechen auf die Tumorbehandlung. Die Prozentangaben beziehen sich auf die Lebensfähigkeit im Vergleich zu patientenangepassten Kontrollorganoiden. Die Dosierungen für die Behandlungen in der Tabelle sind wie folgt: Cisplatin (10 μM), Doxorubicin (1 μM), Vincristin (1 μM), Etoposid (1 μM), Cisplatin/Doxorubicin (10 μM/1 μM), Cisplatin/Etoposid (10 μM). /1 μM) und Vincristin/Doxorubicin (1 μM/1 μM). Grüne Kästchen stellen Behandlungen dar, die zu einer Verringerung der Lebensfähigkeit um < 50 % und p > 0,05 führen, gelbe Kästchen > 50 % oder p < 0,05, rote Kästen stellen Behandlungen mit einer Verringerung der Lebensfähigkeit um > 50 % und p < 0,05 dar. Das Endergebnis ist die Anzahl der Zapfwellensätze, bei denen die Behandlung wirksam ist (< 50 % lebensfähig und p < 0,05). Die Spalte ganz rechts stellt die Anzahl der wirksamen Behandlungen im jeweiligen Patienten-Organoid-Set dar.

Anwendung einer personalisierten Chemotherapie-Behandlungsplattform für (a) MCC2 und (b) MCC5 mit (i) Cisplatin. (ii) Doxorubicin. (iii) Vincristin. (iv) Etoposid. (v) Cisplatin/Doxorubicin. (vi) Cisplatin/Etoposid und (vii) Vincristin/Doxorubicin. Die Zusammenfassung der CellTiter-Glo 3D-Assay-Ergebnisse für (a) MCC2 zeigt dosisabhängige Behandlungsreaktionen für (i) Cisplatin (ii) Doxorubicin (iii) Cisplatin/Doxorubicin und (vii) Vincristin/Doxorubicin, während (b) MCC5 diese Ergebnisse veranschaulicht (i) Cisplatin und (iii) Cisplatin/Doxorubicin. Unter jeder Dosis werden Replikate als Datenpunkte aufgeführt. *p < 0,05.

Um die Mechanismen hinter der Wirksamkeit der Immuntherapie effektiv zu untersuchen, haben wir aus Vollblut oder normalem Lymphknotengewebe isolierte Immunzellen in unsere PTO-Kulturen integriert, um immunverstärkte Patiententumororganoide (iPTOs) zu bilden. Nach sieben Tagen in der Kultur wurde eine Immuntherapie mit drei für MCC zugelassenen Behandlungen durchgeführt: Pembrolizumab, Ipilimumab und Nivolumab. Basierend auf unseren Kriterien für eine iPTO-Behandlungswirksamkeit von < 50 % iPTO-Lebensfähigkeit im Vergleich zur Kontrolle mit statistischer Signifikanz gegenüber der passenden iPTO-Kontrolle und dem behandlungsangepassten PTO bestätigten ATP-Lebensfähigkeitstests und konfokale Mikroskopie für keines von ihnen eine signifikante Immuntherapiewirkung auf unsere Immunorganoide Die sieben getesteten iPTO-Sets wiesen eine Lebensfähigkeit nach der Behandlung im Bereich von (55–110 %) für Pembrolizumab, Ipilimumab (63–108 %) und für Nivolumab (74–120 %) auf (Abb. 5). Die IHC-Analyse behandelter Organoide zeigte eine minimale immunvermittelte Zytotoxizität, gemessen anhand der Granzym-B- und Caspase-3-Aktivität in Tumorzellen, und zeigte gleichzeitig das Vorhandensein von CD8+-T-Zellen im Verlauf des Untersuchungszeitraums im Vergleich zu Kontrollen (Abb. 6a), Ergänzende Abbildungen . S3, S4, S5). Die Messung der LDH-Werte, eines Markers für zellulären Stress und Gewebeschäden, zu mehreren Zeitpunkten nach der Behandlung für MCC7 und MCC9 ergab niedrigere LDH-Werte nach 24 und 48 Stunden für MCC9, was auf eine Therapieresistenz von iPTO zu Beginn der Behandlung hindeutet (Abb. 6bi, ii). ).

Demonstration von iPTOs in Immuntherapie-Testanwendungen. (a) iPTO-Sets wurden mit Immuntherapien behandelt und die Lebensfähigkeit wurde mit CellTiter-Glo 3D aufgezeichnet. Es wurde festgestellt, dass keine iPTOs eine signifikante Reaktion von < 50 % Lebensfähigkeit im Vergleich zur Kontrolle, eine statistische Signifikanz von p < 0,05 im Vergleich zur iPTO-Kontrolle und eine PTO-Gegenbehandlung zu allen getesteten Immuntherapien aufwiesen. (b) LIVE/DEAD-Panel für MCC8. Maßstabsbalken repräsentieren 250 Mikrometer. *p < 0,05.

Vergleichende Analyse zeitlich getrennter Tumoren desselben Patienten. (a) Die Immunhistochemie von iPTOs zeigt robuste CD8+-T-Zellpopulationen, aber eine durch niedriges Granzym B vermittelte Abtötung von CK20+-Zellen. (b) Die LDH-Zellstressanalyse stellt einen Anstieg des iPTO-Satzes von Pembrolizumab MCC7 fest, nicht jedoch von MCC9, was auf den Erwerb einer Resistenz zwischen den beiden Tumoren bei diesem Patienten schließen lässt. Alle Bilder wurden mit 40-facher Vergrößerung und einem Maßstabsbalken von 20 μM aufgenommen. *p < 0,05.

Die Einbeziehung von PTOs in ein präklinisches Modell erfordert eine klinische Korrelation. Insgesamt wurden vier chirurgische Proben in Längsrichtung von zwei Patienten zu verschiedenen Zeitpunkten während ihrer Behandlung mit Pembrolizumab entnommen (Tabelle 1). Der erste Patient (MCC3) wies zunächst eine primäre Läsion im Gesicht mit zusätzlichen besorgniserregenden Bereichen mit metastatischer Tumoraktivität im Mediastinum und Becken auf der PET/CT-Bildgebung auf. Dieser Patient unterzog sich einer Resektion des primären MCC im Gesicht und begann mit der adjuvanten Gabe von Pembrolizumab und erhielt vier Infusionen, bevor er von der Krankheit verschwand. Die entsprechenden iPTOs zeigten nach der Behandlung eine Lebensfähigkeit von 56 % (Abb. 3).

Der zweite Patient (iPTO setzt MCC2, MCC7, MCC9) entwickelte 10 Jahre nach der ersten MCC-Extremitätenresektion ein Gesichtsrezidiv (MCC2). PET/CT zeigte neue Metastasierungsbereiche an mehreren Stellen im Gesicht und am Hals. Sieben Zyklen adjuvantes Pembrolizumab führten zu einem gemischten klinischen Ansprechen auf die Behandlung. Insbesondere wurde eine Reaktion bei den metastatischen Läsionen am Hals beobachtet, während der Patient ein Fortschreiten der Krankheit mit einer neuen Gesichtsläsion im Transit entwickelte, die zur lokalen Kontrolle reseziert wurde, während der Patient weiterhin behandelt wurde (MCC7). Zwei zusätzliche Zyklen von Pembrolizumab-Infusionen verhinderten nicht die Entwicklung eines neuen, schnell wachsenden Gesichtstumors (MCC9), der ebenfalls reseziert wurde. Ein Vergleich der PTO-Chemotherapie-Behandlungen zeigte eine erhöhte Resistenz gegenüber den meisten Einzelwirkstoffbehandlungen und Kombinationstherapien (Abb. 3). MCC2-iPTOs zeigten keine Patientenempfindlichkeit gegenüber Pembrolizumab (86 % Lebensfähigkeit nach der Behandlung). Die wiederkehrende Läsion (MCC7) zeigte eine Lebensfähigkeit von 57 % nach Pembrolizumab und einen Anstieg des LDH 24, 48 und 72 Stunden nach der Behandlung mit Pembrolizumab (Abb. 5a, 6bi). Schließlich zeigte MCC9 keine Empfindlichkeit gegenüber Pembrolizumab mit einer Lebensfähigkeit nach der Behandlung von 119 %, einem verringerten LDH-Spiegel und einem Mangel an Granzym B- und Caspase 3-Aktivität (Abb. 3, 5a, 6bii). Die Expression von Granzym B und Caspase 3 in behandelten PTO-CK20+-Tumorzellen nahm ab, wenn der iPTO-Satz MCC2 mit den späteren Sätzen MCC7 und MCC9 verglichen wurde (ergänzende Abbildung S5).

Fortschritte in der MCC-Forschung wurden lange Zeit durch den Mangel an Gewebemodellen und die Seltenheit von Krankheiten behindert. Hier beschreiben wir die Erstellung von PTOs aus resezierten chirurgischen Proben ohne Zellexpansion, die eine Betriebsverfügbarkeit und schnelle Tests innerhalb einer Woche nach der Erstellung ermöglichen. Mehrere Chemotherapie- und Immuntherapieschemata wurden hinsichtlich ihrer zytotoxischen Wirksamkeit verglichen. Dies zeigte das Potenzial, sowohl personalisierte Behandlungen für den einzelnen Patienten auszuwählen als auch die Möglichkeit einer Skalierung für therapeutisches Screening in präklinischen Studien. Darüber hinaus stimmte die klinische Reaktion auf die Immuntherapie von vier MCC-Proben von zwei Patienten mit der Reaktion ihrer entsprechenden iPTOs überein. Die Optimierung dieser PTOs kann unser Verständnis dieser seltenen Krebsart erweitern und möglicherweise die Auswahl systemischer Behandlungen verbessern.

Seit der ersten Entwicklung von PTOs wurde die Theorie aufgestellt, dass sie neben ihrer Fähigkeit als Forschungsmodell für neue Therapien auch als Vergleichsmodell für die Therapieauswahl von Patienten dienen könnten. Tatsächlich haben mehrere Studien einen hohen positiven und negativen Vorhersagewert für PTOs verschiedener Tumorarten gezeigt21,22,23,24. Obwohl Tests, die PTO und klinisches Ansprechen korrelieren, unterschiedlich sind, wurde eine erhebliche Abnahme der PTO-Lebensfähigkeit oder des PTO-Wachstums routinemäßig als Schwelle für die zytotoxische Wirksamkeit und Korrelation verwendet. Indem wir zur Bestimmung der Wirksamkeit einen strengen Schwellenwert von 50 % der Lebensfähigkeitsreduktion heranzogen, haben wir in früheren Studien zu Melanomen und Blinddarmkrebs sowohl positive als auch negative PTO-Korrelationen gezeigt15,18. In dieser Studie haben wir die Lebensfähigkeit auch mittels konfokaler Mikroskopie und des LDH-Gehalts bewertet, diese wurden jedoch aufgrund des geringen Durchsatzes nur als unterstützende Tests verwendet. Eine iPTO-Korrelation mit dem klinischen Ansprechen wurde bei vier Proben beobachtet, die zuvor adjuvant mit Pembrolizumab, einem PD-1-Inhibitor, behandelt wurden. iPTO-Sets, die aus nicht reagierenden resezierten Proben entwickelt wurden, zeigten das Vorhandensein von CD8+-Zellen mit geringen Mengen an Granzyme B, einer Zelllebensfähigkeit nach der Behandlung von > 50 % und verringerten LDH-Spiegeln, was auf eine geringe zytotoxische Aktivität innerhalb der iPTOs trotz der Anwesenheit von Checkpoint-Inhibitoren hindeutet. Die hier präsentierten Organoid-Ergebnisse werden künstlich auf eine fehlende Reaktion auf die Immuntherapie verzerrt, da bei den entsprechenden Patienten die Immuntherapie versagte und eine Operation nur durchgeführt wurde, um eine lokale Kontrolle zu erreichen. Daher können diese Ergebnisse nicht als Hinweis darauf herangezogen werden, dass die Immuntherapie bei Merkelzelltumoren nicht wirkt. In einer multizentrischen Phase-2-Studie wurde eine Ansprechrate von 56 % (14/25) bei mit Pembrolizumab behandelten Patienten beobachtet25. Das klinisch beobachtete gemischte Ansprechen auf die Immuntherapie zusammen mit der Abnahme der Expression dieser histologischen Marker in resezierten Läsionen, die unter Immuntherapie fortschreiten, ist ein Hinweis auf eine klonale Evolution mit gleichzeitig vorhandenen malignen Klonen, die unterschiedlich auf die Behandlung ansprechen. Dies ist ein klarer Beweis dafür, dass jede von den PTOs gezeigte Reaktion nur die biopsierten Läsionen widerspiegelt, die zur Entwicklung der Organoide verwendet wurden, und nicht unbedingt repräsentativ für die Gesamtreaktion des Patienten in Fällen ist, in denen Tumorklonalität in räumlich unterschiedlichen Tumoren vorliegt.

Die Immuntherapie für MCC wurde erstmals im Jahr 2017 zugelassen. Seitdem wurden mehrere Wirkstoffe entwickelt, die nachweislich das Überleben der Patienten verbessern25,26,27. Eine beeinträchtigte Immunfunktion ist mit einer erhöhten MCC-Prävalenz verbunden, weshalb28 eine verbesserte Immunerkennung von Tumorzellen erhebliche Vorteile für behandelte Patienten bieten kann29. Das Merkelzell-Polyomavirus wird bei etwa 80 % der Patienten identifiziert und erzeugt in den betroffenen Zellen sowohl eine proonkogene als auch eine anti-apoptotische Signalübertragung30,31. Durch die Anzeige einer zuverlässig passenden Expression von MCPyV sowohl in exzidierten Tumoren als auch in passenden PTOs kann sich die vorgestellte Organoid-Plattform als nützlich für die Untersuchung und Entwicklung antiviraler Vektoren oder die Entwicklung von MCC-Impfstoffen in Fällen erweisen, in denen vom Patienten abgestimmte Antigen-präsentierende Zellen in die Co-Kultivierung integriert werden Bedingungen7,18.

Die hier angegebene PTO-Etablierungsrate von 89 % steht im Einklang mit anderen großen Studien, in denen häufigere Krebsarten wie Dickdarm- und Brustkrebs untersucht wurden21,32 (Tabelle 1). Unsere Studie nutzt ein hochcharakterisiertes Hydrogel, das zur kontrollierten Vernetzung fähig ist und konsistente und reproduzierbare Ergebnisse liefert, die in der Lage sind, primäre Gewebezellen ohne die Notwendigkeit xenogener Faktoren zu unterstützen. Weitere Arbeiten mit PTOs könnten die Schaffung und den Einsatz von Hydrogelen mit hochgradig maßgeschneiderten Zusammensetzungen ermöglichen, die an das gewünschte Gewebe angepasst sind. Der beschriebene 10-tägige Arbeitsablauf für die Organoid-Biofabrikation zur Generierung von Chemosensitivitäts- und Immunsensitivitätsergebnissen stellt ein translationales Forschungsinstrument dar, das sich nahtlos in die klinischen Bedürfnisse eines Patienten integrieren lässt und nach der Validierung möglicherweise die Art und Weise verändern könnte, wie Kliniker Behandlungsentscheidungen treffen, von der Kohortenanalyse bis hin zur Kohortenanalyse personalisierte Entscheidungen. Dies ist besonders wichtig für seltene Tumoren, bei denen Daten aus klinischen Studien fehlen. Schließlich ermöglichten uns PTOs die Bewertung mehrerer Chemotherapie-Kombinationen auf Synergie (Abb. 3). Den Patienten könnten unnötige Toxizitäten erspart bleiben, wenn in Fällen, in denen kein Synergismus beobachtet wird, Kombinationstherapien für das wirksamste Medikament ausgewählt werden können. Die obige Arbeit zeigt, wie wichtig es ist, Gewebe aus herkömmlichen Tumorbanken mit „totem“ Gewebe in Biorepositorien für lebendes Gewebe umzuleiten.

Obwohl wir ein neuartiges PTO-Modell für MCC erstellen und testen konnten, gibt es bei unserer Forschung noch einige Einschränkungen. Die bescheidene Aussagekraft der Studie ist eine direkte Auswirkung der Seltenheit von MCC. Eine klinische Korrelation war nicht bei allen Proben möglich, da bei einer Reihe von Patienten Kontraindikationen für eine systemische Behandlung, einschließlich Immuntherapie, auftraten5. Die dargestellte klinische Korrelation beschreibt einen negativen Vorhersagewert, da viele resezierte Proben von Tumoren stammten, die klinisch resistent gegen eine systemische Behandlung waren. Es ist jedoch logisch, dass das Überleben der Patienten letztendlich von nicht reagierenden Klonen abhängt. Daher ist die Identifizierung von Nicht-Respondern wichtig, um ineffektive Behandlungen sowie die damit verbundenen behandlungsbedingten Toxizitäten und Kosten zu vermeiden. Die Ermittlung eines positiven Vorhersagewerts wird ein notwendiger Endpunkt zukünftiger Studien sein. Obwohl Bestrahlung eine potenzielle Behandlungsoption für MCC darstellt, haben wir diesen Behandlungsparameter nicht in unsere Studie einbezogen, wie zuvor in anderen Vorwahlen beschrieben33.

Trotz der Versprechen von PTOs in der MCC- und anderen seltenen Krebsforschung sind Organoide noch nicht bereit für den Einsatz in der klinischen Praxis, ohne ausreichend fundierte korrelative Daten mit Patientenergebnissen. Die Einführung von Organoiden als korrelative Instrumente in prospektiven randomisierten klinischen Studien ist der Weg, um eine umfassende genomische und proteomische Charakterisierung voranzutreiben. Die routinemäßige Etablierung und Immunstärkung von MCC-PTOs ist direkt aus resezierten chirurgischen Proben möglich, was eine personalisierte Forschung und Erforschung von Behandlungsschemata im präklinischen Umfeld ermöglicht.

Alle Methoden wurden gemäß institutionellen Richtlinien in Übereinstimmung mit den Richtlinien von Wake Forest Baptist Health durchgeführt.

Gewebe-, Blut- und Lymphknotenproben wurden von erwachsenen Patienten mit MCC mit informierter Einwilligung entnommen, die sich zwischen Dezember 2018 und Januar 2022 einer Resektion unterzogen. Die Proben wurden gemäß einem IRB-Protokoll entnommen, das vom Wake Forest Human Research Protection Program genehmigt wurde. Die Proben wurden in Medien des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) gegeben und zur Verarbeitung innerhalb eines postoperativen 2-Stunden-Rahmens an das Wake Forest Organoid Research Center (WFORCE) übertragen.

Nach der Gewebeentnahme wurden die Tumore in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 100 U/ml Penicillin-Streptomycin, 5 mg/ml Gentamicin und 5 mg/ml Amphotericin B für zwei 5-Minuten-Zyklen gewaschen. Wenn möglich, wurde ein Teil jeder Probe entnommen und für die Histologie verwendet; Dies wurde durchgeführt, wenn die Gewebe groß genug waren, um Organoidstudien vorzubereiten. Die Proben wurden zerkleinert und in einem 15-ml-Konus in einer 3-ml-Lösung von Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mit 100.000 CDA-Einheiten/ml Kollagenase HA (001-1050; VitaCyte, Indianapolis, IN), 22.000 Einheiten/ml Protease (003) platziert -1000; VitaCyte) und 200 U/ml DNAse 1 (07470; STEMCELL, Cambridge, MA) pro Gramm Gewebe für bis zu 60 Minuten unter Rühren bei 37 °C. Nach vollständiger Gewebeauflösung wurde die enzymatische Verdauung mit FBS enthaltendem kaltem Kulturmedium beendet und die resultierende Tumorlösung durch ein Vakuumfiltrationskit (SCNY0060; Millipore Sigma, Burlington, MA) filtriert und dann zentrifugiert, um das Zellpellet zu isolieren. Der Überstand wurde entfernt und das Zellpellet gemäß dem Firmenprotokoll mit Red Blood Cell Lysis Buffer (Abcam, Cambridge, UK) resuspendiert. Der Lysepuffer wurde entfernt und die Zellen wurden unter Verwendung eines NucleoCounter NC-200 (Chemometec, Dänemark) gezählt. Den Patienten wurde Vollblut zur Gewinnung von Lymphozyten unter Verwendung von Ficoll-Paque PLUS und dem entsprechenden Protokoll (GE Healthcare, Chicago, USA) entnommen. Für die iPTO-Herstellung wurde ein normaler Lymphknoten eines Patienten entnommen. Lymphknoten wurden ähnlich wie ganzes Gewebe wie oben beschrieben verarbeitet.

Das Tumorzellpellet wurde mit einem Thiol-modifizierten Hyaluronan/Heparin (Heprasil; Advanced Biomatrix, San Diego, CA) resuspendiert, das gemäß den Anweisungen des Herstellers zubereitet und mit 0,1 % w/v Irgacure 2959 (5200, Advanced BioMatrix, San Diego, CA) versetzt wurde ein Photoinitiator und 3 mg/ml methacrylierte Kollagenlösung (PhotoCol; Advanced Biomatrix) im Volumenverhältnis 1:3 bei einer Zelldichte von 10 Millionen Zellen/ml. Von Patienten stammende Tumororganoide (PTOs) wurden durch Aussäen von 5 µL der Hydrogel/Zell-Mischung in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Platte ohne Gewebekultur erzeugt und durch Einwirkung von ultraviolettem Licht (365 nm, 18 W/cm2) photovernetzt. von einer BlueWave 75 V.2 UV-Punktlampe (Dymax Corp., Torrington, CT) für 1 s, um Organoide zu vernetzen. PTOs wurden in 200 ml Medien kultiviert, die DMEM-F12 mit 5 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin, 1 % L-Glutamin, 50 ng/ml EGF (PHG 0313; ThermoFisher Scientific), 10 µM Y-27632 (S1049, Selleckchem) enthielten , Houston, TX) mit Medienwechsel alle 3–4 Tage.

Immunverstärkte PTOs (iPTOs) wurden durch Kombination der immunkompetenten Zellen aus passendem Patientenvollblut (Blut-iPTOs) oder Knotenlymphgewebe (Lymph-iPTOs) im Verhältnis 3:1–5:1 je nach Zellausbeute mit Tumorzellen und Aussaat erzeugt Wie oben beschrieben auf Teller verteilen. Die Organoide enthalten neben Tumor- und CD8+-Zellen auch CD4+- und APC-Zellen sowie Stroma, wie zuvor beschrieben15,18. Organoide wurden vor der Behandlung 7 Tage lang kultiviert.

Anschließend wurden die Organoide nach 7 Tagen Kultur behandelt. Zu den Chemotherapien gehörten Cisplatin (1, 10, 100 µM) (232120, Sigma Aldrich), Doxorubicin (0,1, 1, 10 µM) (S1208, Selleckchem), Vincristin (0,1, 1, 10 µM) (V8879 Sigma Aldrich), Doxorubicin mit Cisplatin (0,1/1, 1/10, 10/100 µM), Cisplatin mit Etoposid (S1125, Selleckchem) (1/0,1, 10/1, 100/10 µM) (Selleckchem) und Doxorubicin mit Vincristin (0,1/0,1). , 1/1, 10/10 µM). Für die Immuntherapie-Behandlung wurden 100 nM Pembrolizumab (A2002, Selleckchem), Ipilimumab (A2001, Selleckchem) oder Nivolumab (A2005, Selleckchem) sowohl auf iPTOs als auch auf PTOs in parallelen Behandlungen verwendet. Das Medium wurde aus den Vertiefungen entfernt und mit Kulturmedium vermischte Arzneimittellösungen wurden hinzugefügt. Die Organoide blieben 72 Stunden lang in der behandelten Medienlösung, bevor die Lebensfähigkeit am Endpunkt beurteilt wurde.

Nach drei Tagen Inkubation in arzneimittelhaltigen Medien wurden die Organoide mit LIVE/DEAD-Färbung, CellTiter-Glo 3D und LDH-GLO-Zytotoxizitäts-Viabilitätstests bewertet. Die LIVE/DEAD-Färbung (L3224; Invitrogen, Carlsbad, CA) wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt und vor der Bildgebung 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Fluoreszenzbildgebung wurde mit einem makrokonfokalen Leica TCS LSI-Mikroskop (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) durchgeführt. Bilder aus roten und grünen Kanälen wurden in maximaler Projektion überlagert und gestapelt.

Die quantitative Lebensfähigkeit wurde mithilfe von CellTiter-Glo 3D Cell Viability (G968B; Promega, Madison, WI) und LDH-GLO-Zytotoxizitätstests (J2381; Promega) bewertet. LDH (Lactose Dehydrogenase) ist ein Enzym, das mehrere notwendige Schritte bei der Energiebildung für die Zelle katalysiert. Die Freisetzung von LDH dient als Marker für zellulären Stress und kann klinisch zur Messung von Gewebeschäden eingesetzt werden. Durch die Beobachtung kleiner Anstiege dieses Markers kann sichergestellt werden, dass diese Zellen keinem Stress oder Zellschaden ausgesetzt sind. Dies kann als nicht-lytische Messung des Zellschadens im Gegensatz zu CellTiter-Glo 3D verwendet werden, allerdings auf Kosten eines sinkenden Assays Durchsatz. Für den CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay wurde die Hälfte des Mediums (100 ml) aus den einzelnen Vertiefungen entnommen und 100 ml Testreagenz in jede Vertiefung gegeben, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur auf einem Schüttler. Der LDH-GLO-Zytotoxizitätstest wurde durchgeführt, indem das Kulturmedium an den Tagen 1, 2 und 3 nach der Behandlung konserviert und der Test am selben Tag gemäß den Herstellerangaben durchgeführt wurde. Die Inhalte beider Tests wurden auf eine 96-Well-Testplatte aus Polystyrol von Costar White (3912; Corning, NY) übertragen und mit einem Veritas Microplate Luminometer (Turner BioSystems, Sunnyvale, CA) analysiert.

Organoide wurden für die Histologie am 10. Tag der Kultur in 4 % Paraformaldehyd für 4 Stunden fixiert. Organoide wurden verarbeitet, in Paraffin eingebettet und zur Färbung in Abständen von 5 μm geschnitten. Organoid- und Gewebeschnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt.

Zur Identifizierung von PTO- und Gewebezellpopulationen wurde eine chromogene Immunhistochemie durchgeführt. Die Antigengewinnung wurde auf ungefärbten Objektträgern unter Verwendung eines Citratpuffers mit pH 6 durchgeführt. Gewebe und Organoide wurden mit Cytokeratin 20 (CK20, ab76126, Abcam), Pan-Cytokeratin (Pan-CK, NBP2-29429, NOVUS, Centennial, CO), Neurofilament (NFH, 13-1300, Thermofisher, Waltham, MA) inkubiert. Synaptophysin (SYP, MA5-14532, Thermofisher), Chromogranin A (ChgA, ab15160, Abcam) und Merkelzell-Polyomavirus-T-Antigen (MCPyV, MABF2316, Millipore Sigma) Primärantikörper über Nacht. Es folgte eine Stunde lang die entsprechende Inkubation mit biotinylierten sekundären Antikörpern (abcam). Anschließend wurden die Objektträger zwei Minuten lang einer DAB-Lösung (SK-4105, Vector Laboratories, Burlingame CA, USA) ausgesetzt und mit Hämatoxylin gegengefärbt. Die Bildgebung wurde mit einem Olympus BX-63-Mikroskop (Olympus, Tokio, Japan) durchgeführt.

Eine zusätzliche Färbung wurde mit fluoreszierender Immunhistochemie (IHC) durchgeführt, um das Ansprechen auf die Behandlung mit der iPTO-Immuntherapie zu charakterisieren. Ungefärbte Objektträger wurden einer Antigengewinnung in einer Citratpufferlösung mit pH 6 unterzogen, bevor sie 30 Minuten lang mit Dako Protein Block blockiert wurden. Fluoreszenz-IHC wurde mit Antikörpern für gespaltene Caspase 3 (9661S, Cell Signaling Technologies, Danvers MA), CD-8 (ab4055, abcam), CK-20 (MA5-13263, Invitrogen) und Granzyme B (ab4059, abcam) durchgeführt Folien im Verhältnis 1:500, 1:200, 1:200, 1:100 bzw. 1:400. Nach Inkubation über Nacht bei 4 °C wurden geeignete speziesreaktive sekundäre Alexa Fluor 488- oder Alexa Fluor 594-Antikörper (Biotium, Fremont, CA) 1 Stunde lang in einer Verdünnung von 1:1000 auf die Proben aufgetragen. Die Schnitte wurden dann 5 Minuten lang mit DAPI inkubiert, bevor sie mit dem Eindecken finalisiert wurden. Zur Abbildung der Schnitte wurde ein aufrechtes Fluoreszenzmikroskop Olympus BX-63 verwendet. Die Pixelquantifizierung für die Fluoreszenzbildgebung wurde mit der ImageJ FIJI-Software durchgeführt.

Es besteht kein Konsens darüber, was die therapeutische Wirksamkeit von Organoiden darstellt. Hier verwenden wir einen konservativen Ansatz, um zu berücksichtigen, dass ein Organoid auf eine Therapie anspricht. Er besteht aus drei unterschiedlichen Kriterien, die gleichzeitig von iPTOs erfüllt werden müssen: (1) eine statistisch signifikante Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen im Vergleich zu unbehandelten (Kontroll-)Organoiden nachweisen ( Bsp.: iPTO-Kontrolle vs. iPTO-behandelt) und (2) zeigen eine statistisch signifikante Verringerung der Zelllebensfähigkeit beim Vergleich behandelter Organoide aus immunverstärkten mit nicht immunverstärkten Gegenzuständen (Bsp.: mit Immuntherapie behandeltes iPTO vs. mit Immuntherapie behandeltes PTO) und ( 3) nach der Immuntherapie eine CellTiter-Glo 3D-Lebensfähigkeit von < 50 % aufweisen.

Ebenso müssen nicht immunverstärkte PTOs zwei Kriterien erfüllen: (1) eine statistisch signifikante Verringerung der Lebensfähigkeit im Vergleich zu unbehandelten PTO-Kontrollorganoiden aufweisen und (2) eine Verringerung der Lebensfähigkeit von CellTiter-Glo 3D nach der Therapie von > 50 % aufweisen. Wir wählten willkürlich eine Reduzierung der Lebensfähigkeit um 50 % als niedrigsten Schwellenwert, der auf ein Ansprechen auf die Therapie hindeutet. Diese Zahl kann basierend auf der gewünschten zu untersuchenden Tumorreaktion oder der Kinetik und Tumorbiologie jedes einzelnen Patienten geändert werden, was die Plastizität der Plattform demonstriert.

Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung für jede Versuchsgruppe ausgedrückt. Jede Bedingungskombination bestand aus 3 oder mehr Organoiden zur Analyse. Die CellTiter-Glo 3D-Testwerte der behandelten Organoide wurden vor der statistischen Analyse auf zustandsangepasste Kontrollen (iPTO oder PTO) standardisiert. Zwei Proben-T-Tests wurden verwendet, um zu beurteilen, ob die Lebensfähigkeit der Zellen zwischen den gewünschten Vergleichsgruppen unterschiedlich war. Zur Bestimmung, ob eine Behandlungsgruppe auf die Therapie ansprach, wurde ein strenger Schwellenwert gewählt. Dieser Schwellenwert erfordert, dass alle Bedingungen für das Ansprechen auf die Behandlung (im vorherigen Abschnitt identifiziert) erfüllt sind, um ein Organoid als Ansprechen auf die Behandlung zu betrachten. Dieser Ansatz wurde verwendet, um die Wahrscheinlichkeit des Auftretens eines Fehlers vom Typ 1 zu verringern. Konkret läge die Wahrscheinlichkeit, dass beide oben beschriebenen t-Tests bei p < 0,05 signifikant wären (und nicht, weil beide Hinweise auf ein Ansprechen auf die Behandlung zeigten), bei 0,25 %. Wenn die Wahrscheinlichkeit, dass die Lebensfähigkeit von CellTiter-Glo 3D nach der Immuntherapie weniger als 50 % beträgt, ein zufälliges Ereignis wäre (d. h. eine 50-prozentige Chance, dass es zufällig eintreten würde), dann wäre die kombinierte Wahrscheinlichkeit, dass alle drei Ereignisse gleichzeitig zufällig auftreten würden 0,125 % oder 12,5 von 10.000 für Immuntherapiestudien. Es wurde festgestellt, dass Arzneimittelscreening-Studien für einen Patienten erfolgreich waren, wenn unbehandelte Kontroll-PTOs am 10. Kulturtag, der mit der Beendigung der Arzneimittelscreenings zusammenfiel, eine ausreichende Lebensfähigkeit zeigten. Eine ausreichende Lebensfähigkeit wird als Blindwert < 1 % der Kontrollbedingung beschrieben. Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., USA) durchgeführt.

Datensätze, die während der aktuellen Studie generiert und/oder analysiert wurden, sind nicht öffentlich verfügbar, da das Risiko besteht, dass Informationen zur Patientenidentifizierung auf der Grundlage der Seltenheit der Krankheit basieren. Sie sind jedoch auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Wir danken Libby McWilliams, Matthew Ebert und Kathleen Perry (Atrium Health Wake Forest Baptist Medical Center) für ihre Unterstützung bei der Gewebebeschaffung und dem Datenmanagement. SDF wird durch einen Zuschuss der National Institutes of Health (T32CA247819) unterstützt. KIV dankt für die Finanzierung durch das NIH/NCI R01CA249087, R01CA258692, die Mesothelioma Research Foundation und das Wake Forest Comprehensive Cancer Center.

Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine, Winston-Salem, NC, USA

Steven D. Forsythe, Preston Laney, Hemamylammal Sivakumar, Aleksander Skardal, Shay Soker und Konstantinos I. Votanopoulos

Abteilung für Krebsbiologie, Wake Forest School of Medicine, Winston-Salem, NC, USA

Steven D. Forsythe, Aleksander Skardal, Shay Soker und Konstantinos I. Votanopoulos

Wake Forest Organoid Research Center (WFORCE), Winston Salem, USA

Steven D. Forsythe, Richard A. Erali, Preston Laney, Shay Soker und Konstantinos I. Votanopoulos

Abteilung für Chirurgie, Abteilung für chirurgische Onkologie, Wake Forest Baptist Health, Wake Forest University, Medical Center Boulevard, Winston Salem, NC, 27157, USA

Richard A. Erali & Konstantinos I. Votanopoulos

Wake Forest Comprehensive Cancer Center, Wake Forest School of Medicine, Winston Salem, USA

Richard A. Erali, Shay Soker und Konstantinos I. Votanopoulos

Abteilung für Biomedizintechnik, Ohio State University, Columbus, OH, USA

Hemamylammal Sivakumar & Aleksander Skardal

Abteilung für Pathologie, Wake Forest School of Medicine, Winston-Salem, NC, USA

Wencheng Li

Die Ohio State University und das Arthur G. James Comprehensive Cancer Center, Columbus, OH, USA

Alexander Skardal

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SDF und RAE planten und führten die Experimente durch und trugen zum Verfassen des Manuskripts bei. HS und PL führten die Experimente durch. WL analysierte die Bilder und trug zum Schreiben bei. AS und SS planten die Experimente und trugen zum Schreiben bei. KIV stellte Proben zur Verfügung, plante die Experimente und beteiligte sich an der Erstellung des Manuskripts.

Korrespondenz mit Konstantinos I. Votanopoulos.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Forsythe, SD, Erali, RA, Laney, P. et al. Anwendung immunverstärkter Organoide bei der Modellierung der personalisierten Merkelzellkarzinomforschung. Sci Rep 12, 13865 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17921-6

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Eingegangen: 08. März 2022

Angenommen: 02. August 2022

Veröffentlicht: 16. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17921-6

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Anwendung immunverstärkter Organoide bei der Modellierung der personalisierten Merkelzellkarzinomforschung