Dünnschicht-Notchfilter als Plattformen für die biologische Bildverarbeitung

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 4494 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Bei vielen Bildverarbeitungsvorgängen wird der Ortsfrequenzinhalt von Bildern verändert. Hier demonstrieren wir die räumliche Frequenzfilterung auf Objektebene unter Verwendung der Winkelempfindlichkeit eines kommerziellen Spektralbandsperrfilters. Dieser Ansatz der rein optischen Bildverarbeitung ermöglicht nachweislich die Erzeugung von Pseudo-3D-Bildern transparenter biologischer und anderer Proben in Echtzeit, beispielsweise menschlicher Gebärmutterhalskrebszellen. Diese Arbeit zeigt das Potenzial nicht-lokaler, nicht-interferometrischer Bildverarbeitungsansätze für Anwendungen in der markierungsfreien Bildgebung biologischer Zellen und der dynamischen Überwachung.

Transparente Objekte, darunter die meisten biologischen Zellen, interagieren nur schwach mit Licht, was in der herkömmlichen Hellfeldmikroskopie zu geringem Kontrast führt. Allerdings führen räumliche Variationen in ihrer Morphologie und ihren optischen Eigenschaften zu lokalen Phasenschwankungen im durch sie hindurchgelassenen Licht. Im einfachsten Fall kann dies durch eine Übertragungsfunktion \(O(x,y) \ approx O_0 e^{i\varphi (x,y)}\) charakterisiert werden. Die annähernd räumlich invariante Amplitude \(O_0\) erzeugt ein strukturloses Intensitätsbild \(|O(x, y)|^2 = |O_0|^2\), während die Form- und Brechungsindexinformationen in der Phasenfunktion \ enthalten sind. (\varphi(x,y)\). Solche Phasenschwankungen können von herkömmlichen Kameras nicht direkt erfasst werden und erfordern daher eine indirekte Erkennung. Zu den beliebten optischen Phasenvisualisierungsmethoden gehören Schlieren-Bildgebung1 sowie Zernike-Phasenkontrast2, Dunkelfeld3 und Differential-Interferenzkontrast-Mikroskopie4. Allerdings können hierfür teure Komponenten oder ein Zugriff auf die Fourier-Ebene erforderlich sein, was die Komplexität und Größe des Systems erhöht. Zu den digitalen Methoden gehören die Ptychographie5,6,7, die Verwendung der Transport-der-Intensitäts-Gleichung8,9,10 oder Phasenabrufalgorithmen wie die Gerchberg-Saxton11- und Fienup-Algorithmen12. Diese können jedoch durch ihren umfangreichen Rechenaufwand eingeschränkt sein.

Die rein optische Bildverarbeitung auf Objektebene bietet eine nichtinterferometrische und kompakte Alternative zur Phasenvisualisierung. Dies wird durch 2D-rauminvariante lineare optische Systeme wie dünne Filme13,14 mit Winkelempfindlichkeiten ermöglicht, die die räumliche Frequenz von Wellenfeldern direkt filtern15. Im Gegensatz zu herkömmlichen rechnerischen oder rein optischen Methoden, die die klassische \(4f\)-Konfiguration16 verwenden, werden optische Phaseninformationsverluste, energieaufwändige Nachbearbeitung und sperrige Konfigurationen im Zusammenhang mit dem Zugriff auf Fourier-Ebenen vermieden. Die Bedeutung kompakter optischer Systeme für die rein optische Bildverarbeitung auf Objektebene ergibt sich aus der Möglichkeit der Integration in tragbare Geräte. Dies kann so unterschiedliche Anwendungen haben wie mobile Diagnostik, Umweltüberwachung und Fernerkundung.

Um zu erklären, wie ein Gerät mit Winkeldispersion eine Bildverarbeitung durchführen kann, ignorieren wir der Einfachheit halber jegliche Polarisationseffekte. In diesem Fall kann der Einfluss der Objektebenen-Fourier-Filterung auf das Ortsfrequenzspektrum des Feldes durch eine optische Übertragungsfunktion \({\mathscr {H}}(k_x, k_y)\)17 beschrieben werden. Unter Verwendung der \(z\)-Achse als optische Achse bezeichnen \(k_{x}\) und \(k_{y}\) die transversalen Ortsfrequenzkomponenten des Wellenvektors \(\vec {k} = (k_x, k_y, k_z)\) und \(k_z = \sqrt{|\vec {k}|^2 - k_x^2 - k_y^2}\). Die Übertragungsfunktion bezieht die verarbeitete Ausgabe nach dem Faltungssatz auf das Eingabefeld.

wobei \({\mathscr {F}}\) die Fourier-Transformation bezeichnet, \(E\) eine beliebige Komponente des elektrischen Feldes darstellt und \(\tilde{E}_{\text {in}} = {\mathscr { F}}\left\{ E_{ \text {in} } \right\}\). Hochpassfilter blockieren beispielsweise niedrige Ortsfrequenzen, um ungestreute Feldkomponenten für die Kantenerkennung18 zu eliminieren, was für die Datenkomprimierung19 und die maschinelle Bildverarbeitung20,21 von grundlegender Bedeutung ist. Eine bemerkenswerte Unterklasse ist die der linearen optischen Übertragungsfunktionen, also \({\mathscr {H}} \propto k_x\) oder \({\mathscr {H}} \propto k_y\), die die räumlichen Ableitungen berechnen können , bis zu einer multiplikativen Konstante, eines eingehenden Wellenfelds entlang der \(x\)- bzw. \(y\)-Richtung. Dadurch können Phasengradienten auf Intensitätsschwankungen abgebildet werden, um eine Phasenvisualisierung im Fall transparenter Proben zu ermöglichen13. Der Einfluss der Polarisation kann in diesen Ansatz einbezogen werden, indem ein dyadischer Tensor der Übertragungsfunktion \(2 \times 2\) verwendet wird.

Die Winkelempfindlichkeit stellt den Mechanismus für die Bildverarbeitung durch die Entsprechung zwischen Einfallswinkeln und Ortsfrequenzen bereit. Dies ergibt sich aus der Darstellung der Ortsfrequenzkomponenten in Kugelkoordinaten15,

wobei \(k_0=|\vec {k}|\) die Wellenzahl ist, während \((\theta , \phi )\) die polaren und azimutalen Ausbreitungswinkel ebener Wellen in Bezug auf die \(z\)- sind. Achse. Unter der Annahme, dass optische Übertragungsfunktionen ebene Wellenreaktionen im \(k\)-Raum darstellen und dass Licht durch die räumliche Fourier-Transformation in gewichtete ebene Wellen zerlegt werden kann15,22, folgt daraus, dass Geräte, die eine winkeldispersive Übertragung aufweisen, zur Objektebene geeignet sind Bildverarbeitung.

In jüngster Zeit haben metaoptische Geräte als ultrakompakte Bildprozessoren große Aufmerksamkeit auf sich gezogen23. Beispielsweise verwendeten Zhou et al.24 photonische Kristalle zur Kantendetektion organischer Proben, während Wesemann et al.25 mithilfe eines resonanten Wellenleitergitters Phasenkontrastbilder menschlicher Krebszellen erhielten. Andere Ansätze umfassten Mie-26,27 oder Fano28-Resonanzen, photonische Spin-Bahn-Kopplungseffekte29,30 und gebundene Zustände im Kontinuum31. Angesichts dieses schnell wachsenden Interesses an der Metaoptik ist es an der Zeit, andere optische Elemente in Betracht zu ziehen, die eine gleichwertige Rolle spielen können. Frühere Arbeiten haben verschiedene Strukturen zur Kantendetektion untersucht, wie z. B. Volumenhologrammfilter32, Fabry-Pérot-Etalons33, verstimmte Interferenzfilter34,35, akusto-optische Modulatoren36 und Gitter37,38,39. Mit Ausnahme der Fourier-Ebenen-Phasenkontrastverfahren behinderte das Aufkommen erfolgreicher digitaler Verfahren zur Bildverarbeitung weitere Fortschritte bei rein optischen Techniken. Angesichts des rasanten Anstiegs der generierten Daten und der damit verbundenen Auswirkungen auf den Energieverbrauch und die Verarbeitungsraten wird dies jedoch erneut überdacht.

Hier demonstrieren wir die Verwendung eines handelsüblichen Dünnschicht-Spektralkerbfilters für die Phasenkontrastbildgebung transparenter Proben. Kerbfilter sind Bandsperrfilter, die üblicherweise in verschiedenen Arten der Spektroskopie eingesetzt werden, um zeitliche Frequenzen über einen bestimmten Bereich zu entfernen40,41. Es wird gezeigt, dass die Winkeldispersion des Sperrbandes des Filters bei der Betriebswellenlänge einen Hochpass-Ortsfrequenzfilter erzeugt. Der hier vorgestellte Ansatz basiert auf der Einführung einer Phasenvorspannung durch Kippen des Filters in Bezug auf die optische Achse, um pseudodreidimensionale Bilder zu erzeugen, die denen ähneln, die bei der Differential-Interferenz-Kontrastmikroskopie erhalten werden. Der erzeugte Kontrast wird durch die Rotationsachse und den Winkel bestimmt, während das Sichtfeld und die Auflösung der Bilder durch die Spezifikationen des optischen Systems bestimmt werden. Wir demonstrieren eine verbesserte Kontrastdarstellung von Wellenfeldern, die durch einen räumlichen Lichtmodulator und ungefärbte biologische Proben eingeführt werden. Unsere Ergebnisse bestätigen eine sofortige Phasenkontrastbildgebung ohne Nachbearbeitung, die eine direkte Bildgebung entweder mit einer Kamera oder mit dem Auge ermöglicht. Die Methode bietet einen alternativen rein optischen Ansatz für die biologische und andere Bildverarbeitung mit Bildgebungsfähigkeiten, die mit herkömmlichen Methoden vergleichbar sind, jedoch einen handelsüblichen Spektralbandsperrfilter verwenden. Ihre Verfügbarkeit und die Einfachheit des vorgeschlagenen Ansatzes machen ihn zu einer schnellen und nützlichen Technik, um Einblicke in Phasenkontrastbilder in jedem Bildgebungssystem zu erhalten. Es bietet daher Potenzial für Entwicklungen in den Bereichen maschinelles Sehen, biologische Bildgebung und dynamische Überwachung.

Das hier untersuchte Gerät ist ein kommerziell erhältlicher Kerbfilter (Thorlabs NF633-25), der eine spezifizierte zentrale Betriebswellenlänge von 633 nm und eine Bandbreite von 25 nm bei normalem Einfall aufweist. Die Transmissionsspektren des Geräts als Funktion des Einfallswinkels wurden experimentell mit der Konfiguration in Abb. 1 gemessen, Einzelheiten finden Sie im Abschnitt „Methoden“. Gebündeltes weißes Licht einer Halogenlampe wurde in verschiedenen Einfallswinkeln durch den Kerbfilter geleitet und auf ein Spektrometer fokussiert. Die mit zirkular polarisiertem Licht erzielten Ergebnisse (Abb. 2a) stimmen mit den Herstellerangaben überein. Inzwischen sind die Ergebnisse für \(p\)- und \(s\)-polarisiertes Licht in den Zusatzinformationen (§S1.1) angegeben. Diese Ergebnisse bestätigen die Bandenunterdrückung bei der Betriebswellenlänge mit einer Bandbreite von etwa 25 nm sowie eine Blauverschiebung des Bandstoppbereichs mit zunehmendem Einfallswinkel. Wenn man den Zusammenhang zwischen Einfallswinkeln und räumlichen Frequenzen betrachtet, stellt man fest, dass der Sperrfilter niedrige räumliche Frequenzen unterdrückt, die mit nahezu senkrechten Einfallswinkeln bei der Bandsperrenwellenlänge verbunden sind.

Die experimentelle Konfiguration zur Erfassung der Transmissionsspektren des Sperrfilters. Hier bezeichnen LP und QWP den linearen Polarisator bzw. die Viertelwellenplatte. Der Schaltplan ist nicht maßstabsgetreu.

Die Modulationsübertragungsfunktionen \(\vert{\mathscr {H}}(k_x, k_y)\vert\) für \(p\)-, \(s\)- und zirkulare Polarisationen wurden aus den gemessenen Transmissionsspektren in Abb . 2a. Linienprofile entlang \(k_y=0\) (Abb. 2b) bei der Bandstoppwellenlänge zeigen annähernd polarisationsunempfindliches Hochpassverhalten mit einer Unterdrückungszone im Bereich der numerischen Apertur (NA) \(0,20\). Dies ist eine Folge der Blauverschiebung der Bandstoppwellenlänge mit zunehmendem Einfallswinkel. Ein wesentliches Merkmal des Geräts ist der Bereich der ungefähren linearen Abhängigkeit von \(k_x\) von Null bis nahezu Eins der Übertragung jenseits der Unterdrückungszone. Dies wird durch die lineare Anpassung (Abb. 2c) der Modulationsübertragungsfunktion für zirkulare Polarisation von \(k_x/k_0 \ungefähr 0,20\) bis \(0,30\) unterstützt, dargestellt durch die Beziehung \(A k_x/k_0 + B\ ). Die Polyfit-Funktion und die Kurvenanpassungs-Toolbox in MATLAB wurden verwendet, um die Anpassungsparameter und ihre Fehlerintervalle als \(A = 5,9 \pm 0,83\) und \(B = -0,97 \pm 0,22\) zu erhalten. Durch Drehen des Filters um \({12}^\circ\) um eine Linie senkrecht zur optischen Achse wird der Vorgang auf \(k_x/k_0 \ungefähr \pm 0,20\) verschoben, um auf diesen Bereich zuzugreifen, der hier als Kontrastzone bezeichnet wird. Diese Funktion des Geräts ermöglicht die Visualisierung von Phasenschwankungen in Wellenfeldern in Form von Intensitätsänderungen.

Das experimentelle Übertragungsverhalten des Filters, das durch schrittweises Drehen des Filters (a) erhalten wurde. Die gestrichelte Linie in (a) gibt die Bandstopp-Wellenlänge von 633 nm an und die Pfeile geben die Breite des Bandstopp-Bereichs bei normalem Einfall an. Das Modulquadrat der Modulationsübertragungsfunktion entlang \(k_y=0\) für verschiedene Polarisationen (b) wird mit den vom Hersteller bereitgestellten Daten verglichen. Die lineare Anpassung der Modulationsübertragungsfunktion für die Zirkularpolarisation in der Kontrastzone ist in (c) angegeben.

Um zu erklären, wie der Sperrfilter einen Kontrast im Zusammenhang mit den Phasengradienten in einem Wellenfeld erzeugt, betrachten Sie normal einfallende, monochromatische ebene Wellen \(E_s(x,y,z)\) der Wellenlänge \(\lambda\) und des Wellenvektors \(\vec {k}\), der sich entlang der z-Achse ausbreitet. Die Quelle beleuchtet eine transparente Probe mit einer Transmissionsfunktion \(O(x, y) = O_0 e^{i \varphi (x, y)}\). Seine Visualisierung erfordert die Hervorhebung der Phasenverschiebungen, die dem durchgelassenen Licht verliehen werden, was als modelliert werden kann

wobei wir hier der Einfachheit halber Vektoreffekte ignoriert haben. Gegeben sei die folgende Eigenschaft für die Fourier-Transformation von Ableitungen:

dann eine lineare optische Übertragungsfunktion und Gl. (3) in Gl. eingesetzt. (1) erzeugt die räumliche Ableitung von \(O(x,y)\),

Dies erzeugt Intensitätsbilder proportional zu \(| \partial \varphi (x,y)/\partial x |^2\) oder \(| \partial \varphi (x,y)/\partial y |^2\), wobei der Kontrast in Regionen erzeugt wird, in denen die Phase entlang der Differenzierungsrichtung variiert.

Der Notchfilter erzeugt näherungsweise die räumliche Ableitung um einen Winkelversatz innerhalb der Kontrastzone. Wenn man in der Nähe des Randes der Kontrastzone bei einem Rotationswinkel von ungefähr \({12}^\circ\) arbeitet, werden niedrige Ortsfrequenzkomponenten entfernt, so dass nur relativ große Phasengradienten übrig bleiben, die Kanten in Bildern entsprechen, wie in den Zusatzinformationen gezeigt (§ S1.2). Daher wären die erzeugten Bilder vergleichbar mit denen, die bei der Schlieren-Bildgebung und der Dunkelfeldmikroskopie erhalten wurden. Durch die Verschiebung des Vorgangs innerhalb der Kontrastzone bei einem Rotationswinkel von \({14}^\circ\), der einer normalisierten Ortsfrequenz von \(k_x/k_0 \ungefähr 0,24\) entspricht, bleibt ein Teil des Hintergrundfelds erhalten, was eine Unterscheidung zwischen ihnen ermöglicht positive und negative Phasengradienten. Diese manifestieren sich als unterschiedliche Graustufenwerte oberhalb bzw. unterhalb des verschobenen \(k\)-Raum-Ursprungs. Daher ermöglicht der Betrieb innerhalb der Kontrastzone eine Phasenvisualisierung durch Zuordnung von Phasenvariationen zu Intensitätsänderungen. Durch das Vorhandensein einiger ungestreuter Komponenten bleibt ein Hintergrund mit einer Intensität ungleich Null erhalten, der sich von der Dunkelfeldbildgebung unterscheidet. Stattdessen wird über Informationen über das Vorzeichen des Gradienten ein pseudodreidimensionaler Kontrast erzeugt, ähnlich dem, der in der Differential-Interferenz-Kontrastmikroskopie beobachtet wird. Darüber hinaus kann die Art des Kontrasts durch Ändern der Rotationsachse gesteuert werden, um Phasengradienten entlang verschiedener Richtungen sichtbar zu machen. Diese bilden die Hauptgrundlage dieses Artikels zur Beschreibung der Kapazität von Notch-Filtern zur Phasenvisualisierung.

Die rein optische Bildverarbeitung wurde experimentell an verschiedenen Proben mit dem Kerbfilter unter Verwendung von zirkular polarisiertem 635-nm-Laserlicht durchgeführt. Die Kantenerkennung von Amplitudenproben wurde erstmals an einem USAF-Auflösungstestziel demonstriert. Einzelheiten und Ergebnisse finden Sie in den Zusatzinformationen (§S1.2). Anschließend wurde die Phasenkontrastbildgebung mit der Konfiguration in Abb. 3 durchgeführt, die im Abschnitt „Methoden“ detailliert beschrieben wird. Ein computergesteuerter räumlicher Lichtmodulator, bestehend aus 1920 \(\times\) 1080 Flüssigkristallpixeln mit \({8}\,\upmu \hbox {m}\), emulierte Phasenprofile menschlicher roter Blutkörperchen (Abb. 4a). Diese wurden unter Verwendung der in Ref. 42 bereitgestellten optischen Eigenschaften modelliert. Das vom räumlichen Lichtmodulator reflektierte kollimierte Licht wurde auf den Kerbfilter abgebildet, der innerhalb der Brennebene zwischen gepaarten Mikroskopobjektiven gedreht wurde, um den Betrieb innerhalb der Kontrastzone des Geräts sicherzustellen. Die übermittelten Bilder wurden dann von einer Kamera erfasst. Das Sichtfeld des Systems wurde durch die Apertur des räumlichen Lichtmodulators und die optischen Komponenten eingestellt.

Die experimentelle Konfiguration zur Bildverarbeitung mit einem räumlichen Lichtmodulator (SLM), wobei L und MO jeweils Linsen und Mikroskopobjektive bezeichnen. Der Schaltplan ist nicht maßstabsgetreu.

Die Ergebnisse sind in Abb. 4b – e dargestellt, wo simulierte und experimentelle Bilder verglichen werden. Ein experimentelles Kontrollbild (Abb. 4b) weist einen schlechten Kontrast auf, wodurch das Objekt praktisch unsichtbar wird, wie es bei schwach absorbierenden Proben zu erwarten ist. Dies wurde durch die Aufnahme des Bildes ohne Kerbfilter unter Verwendung der Konfiguration in Abb. 3 erreicht. Ein simuliertes Phasenbild (Abb. 4c) wurde mithilfe numerischer Simulationen in Python erhalten, die im Abschnitt „Methoden“ detailliert beschrieben werden. Das entsprechende experimentelle Phasenbild (Abb. 4d) wurde unter Verwendung des gedrehten Kerbfilters in der Konfiguration in Abb. 3 erhalten. Sowohl im simulierten als auch im experimentellen Fall wurde der Kerbfilter um einen Winkel von \({14}^\circ) gedreht \), um auf die Kontrastzone zuzugreifen. Diese bewahrten einige ungestreute Beiträge, die aus ihren Hintergrundintensitäten ungleich Null ersichtlich sind. In beiden Fällen werden Bereiche, in denen eine Phasenänderung vorliegt, also \(\nabla \varphi (x,y) \ne 0\), mit einem Intensitätskontrast sichtbar gemacht, der aus ansonsten unsichtbaren Phasenmodulationen resultiert.

Die Bildverarbeitung wurde an einem transparenten roten Blutkörperchen (a) durchgeführt, das durch einen räumlichen Lichtmodulator mit einer Phasenabweichung von \(6\pi /5\) emuliert wurde. Ein experimentelles Kontrollbild, das ohne den Kerbfilter erhalten wurde, ist in (b) dargestellt, während simulierte (c) und experimentelle (d) Phasenbilder, die durch den Kerbfilter erzeugt wurden, die Phasenvisualisierung zeigen. Die Intensitätsbilder (b)–(d) sind auf ihre hellsten Pixel normiert, während die Linienprofile entlang der gestrichelten Linien in (a), (c) und (d) in (e) angegeben sind.

Die Mikrometerauflösung, angezeigt durch die Maßstabsbalken auf den Bildern in Abb. 4a – d, wurde durch das optische System bestimmt. Die resultierenden Phasenbilder besaßen außerdem die Fähigkeit, zwischen positiven und negativen Phasengradienten zu unterscheiden, was zum Auftreten eines pseudodreidimensionalen Phasenkontrasts führte. Darüber hinaus weisen Linienprofile (Abb. 4e) Intensitätsschwankungen auf, die mit Phasenschwankungen verbunden sind, die durch die Probe in das Feld eingeführt werden. Es sind auch einige Intensitätsartefakte zu erkennen, die beispielsweise aus Amplitudenschwankungen im Feld und Ringartefakten im Zusammenhang mit dem Gibbs-Phänomen entstehen, die die Probe umgeben.

Um mögliche Anwendungen zu veranschaulichen, wurde Phasenkontrastmikroskopie an biologischen Proben mit schwachem Amplitudenkontrast durchgeführt. Dies wurde mithilfe einer umgekehrten Mikroskopkonfiguration erreicht, die in Abb. 5a dargestellt und im Abschnitt „Methoden“ beschrieben ist. Als Probe wurde eine aus menschlichem Gebärmutterhalskrebs stammende Zelllinie (HeLa) verwendet. Die Vorbereitungsschritte sind im Abschnitt „Methoden“ beschrieben. Ihr Hellfeldbild (Abb. 5b), das ohne Kerbfilter aufgenommen wurde, zeigt einen schlechten Kontrast und wenig bis gar keine Details zu den Zellmerkmalen. Die Platzierung des Sperrfilters direkt unter der Probe ermöglichte jedoch die Visualisierung der Phasenvariationen bei Beleuchtung mit 635-nm-Laserlicht bei einem Einfallswinkel von \({14}^\circ\). Das innerhalb der Kontrastzone erhaltene Phasenkontrastbild (Abb. 5c) enthält morphologische Details, die im entsprechenden Hellfeldbild fehlen, wie beispielsweise diejenigen, die in den gestrichelten Kreisen hervorgehoben sind. Der erzeugte Phasenkontrast ist im Vergleich zum relativ kontrastarmen Hellfeldbild deutlich erhöht. Zelldicke und lokale Abweichungen des Brechungsindex werden hervorgehoben, um die Zellen von ihrem Hintergrund zu unterscheiden.

Die biologische Phasenbildgebung wurde unter Verwendung des experimentellen Schemas in (a) durchgeführt. Die gestrichelte Linie stellt die HeLa-Zellen in einer Petrischale dar und das Schema ist nicht maßstabsgetreu. Ein Hellfeldbild der HeLa-Zellen, das ohne Kerbfilter erhalten wurde, ist in (b) dargestellt. Das entsprechende mit dem Filter erhaltene Phasenkontrastbild ist in (c) und ein Differentialinterferenzkontrastbild in (d) dargestellt. Die in (b)–(d) dargestellten gestrichelten Kreise heben Bereiche hervor, in denen der Kontrast zu Vergleichszwecken deutlich erhöht war.

Als Basis für den Vergleich wurde ein herkömmliches Differentialinterferenzkontrastbild derselben Zellregionen unter Verwendung der im Abschnitt „Methoden“ beschriebenen Konfiguration erstellt. Das resultierende Bild (Abb. 5d) zeigt auch einen signifikanten Phasenkontrast im Vergleich zum Hellfeldbild (Abb. 5a). Es zeigt sich, dass die Qualität des Bildes mit der des zugehörigen Bildes, das mit dem Kerbfilter erhalten wurde, vergleichbar ist (Abb. 5b). Darüber hinaus wurden beide Bilder in einer Mikroskopkonfiguration aufgenommen, deren Auflösung durch die zugrunde liegenden optischen Komponenten bestimmt wurde. Die Auflösung im Mikrometerbereich wurde erreicht, wie durch die Maßstabsbalken in den Bildern angegeben. Dadurch wurden Merkmale in der Größenordnung von Mikrometern vom System aufgelöst und vom Kerbfilter sichtbar gemacht.

Inspiriert durch den jüngsten Anstieg des Interesses an metaoptischer Bildgebung stellen diese Ergebnisse die erste Demonstration der biologischen Bildverarbeitung unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kerbfilters dar. Der Ortsfrequenzinhalt von Bildern wurde durch das Gerät direkt in der Objektebene geändert, ohne dass auf die Fourier-Ebene zugegriffen werden musste. Die Übertragungsfunktion zeigte das erforderliche Verhalten für eine Hochpassfilterung, die eine Kantenerkennung ermöglicht, zusätzlich zu annähernd linearen Bereichen, die eine Phasenvisualisierung durch räumliche Differenzierung ermöglichen. Durch Drehen des Filters konnte auf diese Regime zugegriffen werden, um den Fourier-Ursprung im \(k\)-Raum zu verschieben.

Der in den Bildern erhaltene Kontrast war im Vergleich zu den zugehörigen Bildern ohne Kerbfilter deutlich erhöht. Die Bereiche der Phasenvariation entsprachen Intensitätsmodulationen im gefilterten Bild. Die Qualität der Bilder war mit denen der Differential-Interferenz-Kontrastmikroskopie vergleichbar. Letzteres nutzt Interferenzeffekte, um in Bildern entlang der Ausrichtung eines Wollaston-Prismas einen pseudodreidimensionalen Kontrast zu erzeugen. Andererseits erzeugte der Sperrfilter einen vergleichbaren, drehrichtungsabhängigen Kontrast ohne relativ teure oder sperrige Komponenten. Die Zernike-Phasenkontrastmikroskopie visualisiert auf ähnliche Weise die Phase von Wellenfeldern durch Ortsfrequenzfilterung. Allerdings kann diese Fourier-Ebenen-Methode im Gegensatz zum Notch-Filter nicht zwischen positiven und negativen Phasengradienten von Wellenfeldern unterscheiden. Darüber hinaus entstehen auch Artefakte in Bildern, wenn die Phasengradienten zu stark sind. Beim Notchfilter werden Phasengradienten bei zu starkem Übergang aus der Kontrastzone verschoben und erscheinen daher nicht im Bild. Allerdings kann es aufgrund der Dicke des Filters zu Artefakten kommen.

In den Zusatzinformationen (§S1.2) wurde gezeigt, dass der Kerbfilter in der Lage war, Bilder zu erzeugen, die denen der Schlieren-Bildgebung ähnelten, indem er nahe dem Rand der Kontrastzone arbeitete. Bei der Schlieren-Methode werden entweder die positiven oder negativen Raumfrequenzen eines Bildes blockiert. In ähnlicher Weise unterdrückt der Notch-Filter Ortsfrequenzen unterhalb des verschobenen \(k\)-Raum-Ursprungs nahe dem Rand der Kontrastzone, während diejenigen darüber durchgelassen werden, was in etwa dem Schlieren-Verfahren entspricht. Darüber hinaus würde der Betrieb innerhalb der Unterdrückungszone zu einer starken Unterdrückung des Lichtdurchgangs durch den Sperrfilter führen, was mit dem Ausschluss niedriger Ortsfrequenzen wie in der Dunkelfeldmikroskopie verbunden wäre. Dies würde Dunkelfeldbilder transparenter Proben erzeugen, die Merkmale starker Phasenvariation, wie etwa deren Kanten, vor einem dunklen Hintergrund hervorheben. Daher bieten kommerzielle Notchfilter eine relativ kostengünstige und leicht verfügbare Alternative für die nichtinterferometrische Phasenvisualisierung durch Bildverarbeitung ohne zusätzliche kostspielige Ausrüstung. Sie sind in der Lage, im Vergleich zu anderen Phasenvisualisierungsmethoden konkurrenzfähige Bilder in Kontrast und Qualität zu erzeugen, was besonders nützlich ist, wenn diese nicht verfügbar oder zu teuer sind. Die Auflösung und das Sichtfeld der mit dem Filter erhaltenen Bilder werden nur durch das optische System begrenzt, in dem sie verwendet werden.

Obwohl der Bandsperrbereich auf das sichtbare Band beschränkt war, wurden verschiedene Filter entwickelt, die das gesamte elektromagnetische Spektrum abdecken. Beispielsweise präsentierten Yuan et al.43 einen photonischen Filter, der im Absorptionsband von Acetylengas einsetzbar ist. Andere umfassen Terahertz44, Infrarot45, Mikrowellen46,47 und kommerzielle Ultraviolettfilter. Diese bergen Potenzial für die Phasenbildgebung im gesamten Spektrum unter Verwendung der in diesem Artikel beschriebenen Methoden mit Anwendungen in der maschinellen Bildgebung und der biologischen Bildgebung über den sichtbaren Bereich hinaus. Eine biologische Live-Überwachung ist möglich, indem der Kerbfilter mithilfe vorhandener Bildsensoren die Strukturdynamik von Proben anhand ihrer Phasenvariationen dynamisch aufdeckt. Weitere Anwendungen umfassen die Umgebungsüberwachung und die Integration in tragbare konventionelle Sensoren zur Bildung phasenempfindlicher Detektoren. Der Einbau von Kerbfiltern in ihre Detektionsebenen würde zu räumlicher Frequenzselektivität und Phasenschwankungen bei ansonsten wahllosen, intensitätsbasierten Geräten führen.

Obwohl der Phasenkontrast durch den Kerbfilter erzeugt wurde, war sein Verhalten in der Kontrastzone nicht vollkommen linear. Darüber hinaus schränkt seine begrenzte numerische Apertur den Bereich der Proben ein, auf die es angewendet werden könnte. Der große Winkelbereich der Unterdrückungszone schränkt zudem den Kontrast auf ausreichend scharfe Merkmale ein. Nicht nur ist der Probenbereich begrenzt, sondern es ist auch eine Drehung des Sperrfilters erforderlich. Schließlich berücksichtigte die hier vorgestellte theoretische und numerische Modellierung nicht die nicht vernachlässigbare Dicke des Sperrfilters, die zu Störungen im Strahlengang führen kann. Dies kann zum Auftreten von Aberrationen führen, wie sie beispielsweise in den kantenverstärkten Bildern in den Zusatzinformationen auftreten (§S1.2). Der Erfolg der hier durchgeführten Experimente gibt jedoch Anlass zur Überzeugung, dass Notch-Filter als Alternative zu bestehenden Phasenkontrast-Bildgebungsverfahren eingesetzt werden können. Darüber hinaus könnten kundenspezifische Dünnschichtgeräte mit reduzierter Dicke entwickelt werden, um Aberrationen zu minimieren und die Übertragungsfunktion anzupassen.

Zusammenfassend wurde in diesem Artikel die rein optische Bildverarbeitung auf der Objektebene in Echtzeit unter Verwendung eines kommerziellen Spektral-Notch-Filters demonstriert. Spektroskopische Messungen bestätigten die winkeldispersive Bandunterdrückung, die für die Hochpass-Ortsfrequenzfilterung und Phasenkontrastbildgebung erforderlich ist. Die Kantenerkennung war durch die Unterdrückungszone möglich, in der ungestreute Feldkomponenten entfernt wurden. Unterdessen führte die Verschiebung der Übertragungsfunktion zu annähernd linearen Bereichen innerhalb der Kontrastzone zu Phasenkontrastbildern, die denen der Differential-Interferenz-Kontrastmikroskopie vergleichbar waren. Ungefärbte biologische Proben, darunter eine aus menschlichem Gebärmutterhalskrebs stammende Zelllinie, die ansonsten unsichtbare Phasenmodulationen auferlegten, wurden durch den Filter sichtbar gemacht. Daher bieten Notch-Filter eine nicht-interferometrische und handelsübliche Alternative zur sofortigen Phasenvisualisierung, die eine gleichwertige Rolle wie andere Phasenbildgebungsmethoden spielen kann. Dies hat erhebliche Auswirkungen auf die markierungsfreie biomedizinische Bildgebung48, einschließlich der medizinischen Diagnostik, des nicht-invasiven Wachstums von Mikroorganismen und der dynamischen Überwachung. Die Ergebnisse eröffnen Entwicklungsmöglichkeiten, die über das sichtbare Band hinausgehen und monolithische räumlich frequenzempfindliche Kameras für die Kommerzialisierung konstruieren.

Numerische Simulationen wurden in Python 3.9.549 durch Implementierung von Gl. durchgeführt. (1) mit der Übertragungsfunktion des Kerbfilters. Die experimentell gemessene Modulationsübertragungsfunktion wurde mit der vom Hersteller bereitgestellten interpolierten Phasenantwort kombiniert, um die optische Reaktion des Sperrfilters zu modellieren. Der in diesem Artikel verwendete Kerbfilter (Thorlabs NF633-25) war 3,5 mm dick und bestand aus dünnen Filmen aus Tantalpentoxid (Ta\(_2\)O\(_5\)) und Siliziumdioxid (SiO\(_2\)). Quarzglassubstrat.

Weißes Licht einer fasergekoppelten (Thorlabs SM600) Halogenlampe (Ocean Insight HL-2000-FHSA) wurde mit einem Mikroskopobjektiv (Nikon U Plan FL 20x/0,15NA) kollimiert. Dieses Licht wurde durch einen linearen Polarisator (Thorlabs LPVIS050-MP) polarisiert, um \(p\)- oder \(s\)-polarisiertes Licht zu erzeugen. Zirkular polarisiertes Licht wurde durch Einführung einer zusätzlichen Viertelwellenplatte (Thorlabs AQWP05M-600) vor der Beleuchtung des Kerbfilters erzeugt. Eine Linse (Thorlabs LA1068-A, \(f={75}\,\hbox {mm}\)) fokussierte das durchgelassene Licht auf ein fasergekoppeltes (Thorlabs M15L01) Spektrometer (Ocean Insight QE6500). Messungen der Transmissionsspektren wurden für Einfallswinkel im Bereich von \({-30}^\circ\) bis \({+30}^\circ\) durchgeführt, indem der Filter schrittweise um \({2}^\circ\) gedreht wurde \).

Fasergekoppeltes (Thorlabs SM600) 635 nm Laserlicht (Thorlabs S1FC635) wurde durch ein Mikroskopobjektiv (Nikon LU Plan 5x/0,15NA) und zwei Linsen (Thorlabs LA1027-A \(f={75}\,\hbox { mm}\) und LA1509-A \(f={100}\,\hbox {mm}\)). Ein linearer Polarisator (Thorlabs LPVIS050-MP) sorgte dafür, dass linear polarisiertes Licht einen reflektierenden räumlichen Lichtmodulator (Holoeye Pluto-2.1-VIS-001 LCOS-SLM) beleuchtete. Es programmierte Phasenprofile menschlicher roter Blutkörperchen mit einer Phasenabweichung von \(6\pi /5\). Das vom SLM reflektierte Licht durchlief eine Viertelwellenplatte (Thorlabs AQWP05M-600), um es in zirkulare Polarisation umzuwandeln. Eine Linse (Thorlabs LA1433-A \(f={150}\,\hbox {mm}\)) und ein Mikroskopobjektiv (Olympus Plan N 20x/0,4NA) verkleinerten das Bild auf dem Kerbfilter in seiner Brennebene. Letzterer wurde mithilfe einer Rotationshalterung um \({14}^\circ\) in Längsrichtung gedreht, um Zugang zur Kontrastzone zu erhalten. Ein Mikroskopobjektiv (Olympus Plan N 20x/0,4NA) und eine Linse (Thorlabs LA1131-A \(f={50}\,\hbox {mm}\)) vergrößerten das gefilterte Bild erneut und fokussierten es auf eine Kamera (Thorlabs DCC1645C). ).

Die Hellfeldmikroskopie wurde mit weißem Licht eines inversen Mikroskops (Nikon Ti-80i) ohne Kerbfilter durchgeführt. Die Beleuchtungsquelle wurde dann durch fasergekoppeltes (Thorlabs SM600) 635-nm-Laserlicht (Thorlabs S1FC635) ersetzt, das durch ein Objektiv (Olympus A4 4x/0,1NA) und einen linearen Polarisator (Thorlabs LPVISC100-MP2) und eine Viertelwellenplatte (Thorlabs) kollimiert wurde AQWP05M-600) erzeugte zirkular polarisiertes Licht. Diese optischen Komponenten befanden sich in einem optischen Käfig, der auf einem XYZ-Tisch montiert war, um den Einfallswinkel zu variieren. Der Kerbfilter wurde direkt unter der Probe auf dem Mikroskoptisch platziert, um eine Phasenkontrastmikroskopie durchzuführen. Ein Mikroskopobjektiv (Nikon LU Plan 50x/LWD) sammelte das gefilterte Licht auf einer Kamera (Andor Zyla sCMOS 4.2P). Abschließend wurde mit einem Mikroskop (Olympus BX60) und einem Mikroskopobjektiv (Olympus Plan N 20x/0,4NA) ein Differentialinterferenzkontrastbild aufgenommen.

Die HeLa-Zellen wurden vom Paul Gleeson-Labor der Abteilung für Biochemie und Pharmakologie und vom Bio21-Institut der Universität Melbourne bereitgestellt. Die Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (Lonza), ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem Rinderwachstumsserum (Gibco), 1x Pen-Strep (Lonza), bei \({37}^\circ \hbox {C}\ gezüchtet. ) mit 5 % Kohlendioxid. Die Zellen wurden 24 Stunden vor der Fixierung auf 35-mm-Glasbodenschalen ausplattiert, bevor sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen wurden.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Autoren danken dem Paul-Gleeson-Labor für die Beschaffung der HeLa-Zellen und Thorlabs für die Bereitstellung nützlicher Daten zu Gerätespezifikationen. SBS dankt außerdem Kenneth B. Crozier für nützliche Diskussionen.

Diese Forschung wurde von der australischen Regierung durch den Zuschuss des Australian Research Council Centre of Excellence (CE200100010) finanziert. SBS dankt außerdem für die Unterstützung des Ernst & Grace Matthaei-Stipendiums und des Australian Government Research Training Program-Stipendiums.

Die folgenden Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Shaban B. Sulejman und Niken Priscilla.

ARC Centre of Excellence for Transformative Meta-Optical Systems, School of Physics, The University of Melbourne, Melbourne, VIC, 3010, Australien

Shaban B. Sulejman, Niken Priscilla, Luke Wesemann, Wendy SL Lee, Timothy J. Davis und Ann Roberts

ARC Centre of Excellence for Transformative Meta-Optical Systems, Fakultät für Elektrotechnik und Elektronik, The University of Melbourne, Melbourne, VIC, 3010, Australien

Wendy SL Lee

School of Physics, The University of Melbourne, Melbourne, VIC, 3010, Australien

Jieqiong Lou & Elizabeth Hinde

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SBS und AR konzipierten und überwachten das Projekt auf der Grundlage der von TJDS vorgebrachten Idee der Verwendung von Kerbfiltern. DSBS führte die theoretischen und numerischen Arbeiten durch, zusammen mit Kantendetektionsexperimenten, die von ARNP unterstützt wurden, LW und WSLL führten die Spektralmessungen und Phasenbildexperimente mit Unterstützung von SBSJL durch und EH holte die HeLa-Zellen zurück und bereitete sie vor. SBS verarbeitete die Daten und erstellte das Manuskript mit Unterstützung von LW, während alle Autoren Feedback gaben.

Korrespondenz mit Shaban B. Sulejman.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Sulejman, SB, Priscilla, N., Wesemann, L. et al. Dünnfilm-Notchfilter als Plattformen für die biologische Bildverarbeitung. Sci Rep 13, 4494 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31528-5

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Eingegangen: 18. November 2022

Angenommen: 14. März 2023

Veröffentlicht: 18. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31528-5

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Dünnschicht-Notchfilter als Plattformen für die biologische Bildverarbeitung