Modulares Mikro

Microsystems & Nanoengineering Band 8, Artikelnummer: 82 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Eine wirksame Eindämmung der COVID-19-Pandemie erfordert einen schnellen und genauen Nachweis des Erregers. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bleibt der Goldstandard für die Bestätigung von COVID-19. In diesem Artikel berichten wir über die Leistung einer kostengünstigen modularen Plattform für mikrofluidische Reverse Transkription (RT)-PCR und RT-Loop-vermittelte isotherme Amplifikation (RT-LAMP), Epidax®, für die Point-of-Care-Testung und -Bestätigung SARS-CoV-2. Diese Plattform ist vielseitig und kann entweder für das Screening mit Endpunkt-RT-PCR- oder RT-LAMP-Tests oder für Bestätigungstests mit Echtzeit-RT-PCR neu konfiguriert werden. Epidax® ist hochempfindlich und erkennt nur 1 RNA-Kopie pro µL für Echtzeit- und Endpunkt-RT-PCR, wobei nur die Hälfte der Reagenzien verwendet wird. Beim Nachweis von SARS-CoV-2-Viren aus 81 klinischen RNA-Extrakten erzielten wir vergleichbare Ergebnisse mit denen einer kommerziellen Plattform. Epidax® kann SARS-CoV-2 auch aus 44 nasopharyngealen Proben ohne RNA-Extraktion mithilfe eines direkten RT-PCR-Assays nachweisen, wodurch die Zeit von der Probe bis zur Antwort mit minimalen Benutzerschritten auf eine Stunde verkürzt wird. Darüber hinaus haben wir die Technologie mithilfe eines RT-LAMP-Assays an 54 klinischen RNA-Extrakten validiert. Insgesamt bietet unsere Plattform eine sensible, kostengünstige und genaue Diagnoselösung für ressourcenarme Umgebungen.

Seit seinem Auftreten im Dezember 2019 breitet sich das schwere Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) mit akutem respiratorischem Syndrom weltweit aus und verursacht Todesfälle, Krankheiten sowie Beeinträchtigungen von Leben und Unternehmen.

Eine wirksame Bekämpfung der COVID-19-Pandemie erfordert einen schnellen und genauen Nachweis des Virus. Die Erstveröffentlichung des SARS-CoV-2-Genoms im Januar 2020 ermöglichte es Unternehmen und Laboren weltweit, verschiedene Tests und Techniken für die COVID-19-Diagnose zu entwickeln1,2,3. Die Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) bleibt der Goldstandard für die Identifizierung von SARS-CoV-2. Da ein umfassendes Testprogramm wahrscheinlich sowohl ein allgemein zugängliches als auch ein schnelles Screening in Kombination mit hochempfindlichen PCR-Bestätigungstests erfordern würde, besteht ein Bedarf an alternativen Methoden zur Identifizierung infizierter Personen, die ausreichend kostengünstig, tragbar und effektiv sind, um vor Ort eine schnelle Diagnose zu ermöglichen von Nutzen. Diese Point-of-Care-Tests (POC) sind ein wichtiges Instrument, das an den Grenzen eingesetzt werden kann, um den internationalen Reiseverkehr und die Wirtschaft zu öffnen.

Weltweit wurden verschiedene kommerzielle Labor- und POC-Tests eingesetzt: Cepheid® Xpert® Jetzt COVID-199 und andere10. Bei den ersten drei handelt es sich um vollautomatische Systeme für das Testen mehrerer Proben mit hoher Empfindlichkeit. Beispielsweise wurde berichtet, dass Xpert® Xpress in seinem 46-minütigen PCR-Test eine Empfindlichkeit von 98,3 % erreichte11. Allerdings ist die Ausrüstung teuer und hat einen großen Platzbedarf, was Scale-up-Tests und den Einsatz in ressourcenarmen Umgebungen einschränkt. COVIDNudge ist eine laborfreie RT-PCR-Plattform, die sieben virale Ziele (RdRp1, RdRp2, E-Gen, N-Gen, N1, N2 und N3) und eine Kontrolle (Ribonuklease P) mit einer Sensitivität von 94 % erkennen kann 90-Minuten-Test8. Die für eine Probe erforderliche übermäßige Anzahl von Vertiefungen (72 Vertiefungen) erhöht jedoch die Komplexität des Vorgangs und macht den Test anfällig für Handhabungs- und Interpretationsfehler. Von der FDA zugelassene POC-Tests mit isothermer Amplifikation, wie z. B. Abbott ID Now COVID-19, können mit einem kleinen tragbaren Gerät positive Proben in nur 5 Minuten und negative Ergebnisse in 13 Minuten erkennen12. Obwohl mit diesem Ansatz schnelle Ergebnisse erzielt werden können, gibt es Berichte über eine begrenzte Testgenauigkeit und -empfindlichkeit11,13.

Der Einsatz von Mikrofluidik für diagnostische Tests, insbesondere in einer POC-Umgebung, ist vorteilhaft, da er Tests mit einer winzigen Probenmenge ermöglicht und möglicherweise eine schnellere Erkennung und Bereitstellung mit weniger Reagenzien ermöglicht14. Es gab zahlreiche Entwicklungen bei mikrofluidischen PCR-Systemen15. Einige Designs bieten mehrere On-Chip-Funktionen zur Probenvorbereitung und -detektion. Diese Systeme sind jedoch nicht modular aufgebaut und müssen beim Einsatz vor Ort noch mit Herausforderungen bewältigt werden. Die meisten PCR-Chips bestehen aus Glas, PDMS oder Kunststoff, die eine geringe Wärmeleitfähigkeit haben und nicht für Anwendungen geeignet sind, die eine schnelle und präzise Temperaturkontrolle innerhalb des Mikrofluidikkanals erfordern16. Um diese Einschränkung zu überwinden, könnten Reagenzien in Bereiche auf dem Chip bewegt werden, die auf die gewünschte Temperatur für die PCR vorgeheizt werden. Dies wurde entweder durch die Verwendung eines Durchflusssystems mit mehreren vorgeheizten Zonen17,18 oder durch den Kreislauf von Reagenzien zwischen vorgeheizten Zonen16 erreicht. Diese Methoden erfordern jedoch hochpräzise programmierbare Spritzenpumpen, die das System sperrig und für POC-Einstellungen ungeeignet machen. Darüber hinaus erhöht die Mehrzonenheizung die Chipkomplexität, was eine Herausforderung für die Massenproduktion darstellt. Dieses Problem wird noch verstärkt, wenn auf einem Chip mehrere Reaktionskammern (z. B. zur Aufnahme negativer, positiver und interner Kontrollen) benötigt werden. Mikrofluidik ermöglicht auch die Verwendung winziger Volumina, wodurch das Volumen der benötigten Reagenzien reduziert wird. Dies ist besonders wichtig bei einer Pandemie, die die Lieferkette von Testreagenzien unterbricht. Es wurde gezeigt, dass ein mikrofluidisches Lab-on-Chip in der Lage ist, PCR an Proben mit Volumina im Nanoliterbereich bis hinunter zu 30 nL19,20 durchzuführen. Obwohl ein kleines Volumen den Reagenzienverbrauch reduzieren könnte, würde ein zu geringes Volumen die Empfindlichkeit des Tests beeinträchtigen. Dies ist noch ausgeprägter, wenn versucht wird, asymptomatische Fälle zu erkennen, bei denen die Eingangsprobe einen sehr niedrigen Virustiter aufweist. Diese Chips im Nanoliterbereich können aufgrund ihres Systemdesigns nicht auf Mikroliter skaliert werden. Zusätzlich zur PCR wurden tragbare Lab-on-Chip-Systeme verwendet, um eine durch Reverse Transkriptionsschleifen vermittelte isotherme Amplifikation (RT-LAMP) für diagnostische Tests durchzuführen21,22,23,24,25,26. Diese Systeme können aufgrund ihrer vereinfachten thermischen Kontrolleinheiten keine PCR durchführen. Die meisten können die Dynamik der Reaktion nicht messen und nur die Endergebnisse erfassen. Darüber hinaus weist RT-LAMP eine geringere Empfindlichkeit als RT-PCR für den Nachweis von COVID-19 auf1,11,27,28.

Wir haben eine kostengünstige, zum Patent angemeldete modulare mikrofluidische RT-PCR- und RT-LAMP-Plattform, Epidax®29, für die schnelle Vor-Ort-Diagnose von SARS-CoV-2 entwickelt. Diese LEGO-ähnliche Plattform umfasst ein On-Chip-Temperaturmodul, ein Erkennungsmodul und Analysesoftware und kann leicht umkonfiguriert werden, um entweder ein COVID-19-Screening durch Endpunkt-RT–PCR- oder RT-LAMP-Tests oder Bestätigungstests durch Echtzeit-RT– durchzuführen. PCR (RT–qPCR). Wir haben festgestellt, dass seine Leistung beim Nachweis von SARS-CoV-2-Viren aus 81 und 43 klinischen RNA-Extrakten mit unseren Endpunkt-RT-PCR- bzw. RT-qPCR-konfigurierten Assays mit den Ergebnissen vergleichbar ist, die mit einem kommerziellen System erzielt wurden, allerdings mit der Hälfte Menge der verwendeten Reagenzien. Darüber hinaus konnten wir einen schnellen direkten RT-PCR-Nachweis von SARS-CoV-2-Viren in 42 Nasopharyngealabstrichproben ohne RNA-Extraktion nachweisen, wodurch die Testzeit von der Probe bis zum Ergebnis auf eine Stunde verkürzt wurde. Schließlich führten wir mithilfe unserer neu konfigurierten RT-LAMP-Plattform den SARS-CoV-2-Nachweis in 54 klinischen RNA-Extrakten durch. Die Modularität der Plattform ermöglicht die Durchführung unterschiedlicher Tests je nach Bedarf und Geschwindigkeit des Anwendungsfalles.

Das Epidax®-System besteht aus einem Temperaturmodul, einem mikrofluidischen Chip, einem Detektionsmodul sowie einer Bildverarbeitungs- und Analysesoftware (siehe Abb. 1a–c). Der Chip lässt sich einfach auf dem Temperaturmodul montieren und mithilfe von Magneten selbstausrichten. Die Temperatur der Probe im Chip wird über einen bestimmten Zeitraum kontrolliert, um eine Amplifikationsreaktion zu ermöglichen. Das Detektionsmodul umfasst eine CMOS-Kamera zur Aufnahme von Fluoreszenzbildern des Chips zu definierten Zeitpunkten (z. B. am Anfangs- und Endzyklus für die Endpunkt-PCR oder am Ende jedes Amplifikationszyklus für die Echtzeit-PCR). Anschließend analysiert die Bildverarbeitungs- und Analysesoftware die aufgenommenen Bilder. Die Reaktionen werden durch die Fluoreszenzintensität der Proben quantifiziert. Die Modularität der Plattform bietet Flexibilität bei der Erstellung von Erkennungsplattformen für verschiedene Probentypen, Erkennungsziele, Protokolle und Bereitstellungsanforderungen. Hier haben wir Epidax® erfolgreich für verschiedene Anwendungen eingesetzt: COVID-19-Screening mithilfe von Endpunkt-RT-PCR oder RT-LAMP, einen Bestätigungstest mithilfe von Echtzeit-RT-PCR an RNA-Extrakten und einen Screening- oder Bestätigungstest mithilfe einer direkten RT –PCR-Assay an Nasopharynxproben ohne RNA-Extraktion.

ein Epidax® im Betrieb, wobei das Detektionsmodul oben auf dem Mikrofluidik-Chip und dem Temperaturmodul platziert ist (für Echtzeit-RT-PCR in einem SARS-CoV-2-Bestätigungstest, bei dem am Ende jedes Amplifikationszyklus ein Bild aufgenommen wird) und ein Bildanalysepaket, das mit einem Laptop bereitgestellt wird; b Epidax® im Betrieb mit abgenommenem Detektionsmodul (für Endpunkt-RT-PCR oder RT-LAMP im SARS-CoV-2-Screening). Proben und Reagenzien werden auf den Chip geladen und zur Verarbeitung gemäß den erforderlichen Protokollen im Temperaturmodul platziert; c Schematische Methode zur Durchführung des gesamten Erkennungs- und Diagnoseprozesses. d Explosionszeichnung des Chips mit Einzelheiten zu seinen Komponenten. Die das Kanalprofil enthaltende Kanalplatte konnte für neue Anwendungen einfach ausgetauscht werden. In der Abbildung ist eine Kanalplatte dargestellt, die aus vier Kanälen als vier unabhängigen PCR-Kammern besteht. Dabei handelt es sich um eine Einwegkomponente des Chips, während andere Komponenten wiederverwendbar sein können. Die Kanalplatte besteht aus einem Schlitz zum Einbau eines Temperatursensors zur Rückkopplungssteuerung zum Peltier-Element; e Ein Vierkanal-Chip für RT-PCR. Jeder Kanal besteht aus einem Einlass, der in einen schlangenförmigen Bereich führt, gefolgt von einem gekrümmten Erweiterungs- und gekrümmten Kontraktionsbereich, der eine augenförmige Kammer bildet, in der sich die Reaktionsmischung befindet, gefolgt von einem weiteren schlangenförmigen Bereich, der zu einem Auslass führt; f Ein Sechskanal-Chip für RT-LAMP, der die Fähigkeit demonstriert, mehr Proben in einem Test zu testen.

Das On-Chip-Temperaturmodul besteht aus dem Mikrofluidik-Chip, einem Peltier-Element mit einer Abstandsplatte und einer Trägerplatte (siehe Abb. 1d). Für die selbstausrichtende Montage des Chips auf dem Thermomodul werden Magnete verwendet, die einen schnellen Wechsel der Prüflinge ermöglichen. Nur der Chip ist wegwerfbar, während das gesamte Modul wiederverwendbar ist, was die Betriebskosten des Systems senkt.

Der Chip besteht aus einer Hauptkanalplatte und einem dünnen Aluminiumklebefilm, der als wärmeleitende Schicht dient und das vom Detektionsmodul gesammelte Fluoreszenzsignal verstärkt. Aluminium hat eine Wärmeleitfähigkeit von 200–237 W/mK, was einige Größenordnungen höher ist als die von Glas, PDMS und Kunststoff (im Allgemeinen weniger als 2 W/mK), die traditionell zur Herstellung von Mikrokanälen verwendet werden. Die geringe Dicke und die hohe Wärmeleitfähigkeit ermöglichen eine hohe Wärmeübertragungsrate in den und aus dem Mikrokanal. Dies ist sehr wichtig, da einige PCR-Protokolle schnelle Temperaturwechsel erfordern. Durch die Verwendung des reflektierenden Aluminiumfilms wird das von fluoreszierenden Proben emittierte Licht zurück zum Detektionsmodul reflektiert, wodurch das Signal, das gesammelt werden kann, im Vergleich zu dem, das mit einer transparenten Wand erhalten wird, erhöht wird (siehe Abb. S1 für den Vergleich der Fluoreszenzintensität mit verschiedenen). Substratmaterialien wie transparentes Glas und Kunststoff). Die hervorragenden thermischen und optischen Eigenschaften des Chips ermöglichen verschiedene Anwendungen, darunter sowohl RT-PCR (zyklische thermische Steuerung) als auch RT-LAMP (isotherme Steuerung), für die die Verwendung herkömmlicher Kunststoff- oder PDMS-Chips mit transparenten Wänden nicht optimal ist.

Die Kanalplatte wurde aus Polymethylmethacrylat (PMMA) mit den Abmessungen 50 mm × 40 mm (L × B) hergestellt. Mit einem CO2-Laser (Universal Laser Systems) wurden ein Sensorschlitz und Löcher für Magnete durchgeschnitten. Der verwendete Temperatursensor war MP-3176 (TE Technology, Inc.). Die Anzahl der Mikrokanäle auf der Kanalplatte kann leicht an verschiedene Testanforderungen angepasst werden. Hier demonstrieren wir vier oder sechs Mikrokanäle auf einem Chip, die jeweils als unabhängige Kammer verwendet werden und das Testen mehrerer Proben ermöglichen. Für RT-PCR-Experimente wurden vier identische Kanalprofile (siehe Abb. 1e) mit einem CO2-Laser (Universal Laser Systems) bis zu einer Tiefe von ~720 μm graviert, und das Gesamtvolumen jedes Kanals betrug ~60 μL. Für RT-LAMP-Experimente wurden Sechskanalprofile (siehe Abb. 1f) bis zu einer Tiefe von ~1,71 mm graviert, was ein Gesamtkanalvolumen von ~98 μL ergab. Jeder Kanal besteht aus schlangenförmigen Bereichen, die als Strömungswiderstände fungieren, und einer augenförmigen Kammer, in der sich die Reaktionsmischung befindet. Während der PCR kann die Temperatur der Probe auf über 90 °C erhöht werden. Die Strömungswiderstände verhindern, dass sich die Probe durch den Anstieg des Dampfdrucks der flüssigen Probe aus der Kammer bewegt. Der Serpentinenbereich fungiert auch als Mischer, um die Proben-Reagenz-Mischung zu verbessern, wenn er in den Mikrokanal injiziert wird. Die augenförmige Kammer verhindert mit ihrer Krümmung und dem Vorhandensein von Öl, dass die Probe unter thermischen Wechselbedingungen in kleinere Teile zerfällt. Darüber hinaus dient das kleine Reservoir an jedem Einlass und Auslass als Auffangbehälter für Flüssigkeiten (Öl usw.), die aufgrund des durch hohe Temperaturen verursachten Dampfdrucks aus dem Kanal ausfließen könnten. Diese Designs können leicht angepasst werden, indem die Tiefe und Breite der Kanäle variiert wird, um sie an unterschiedliche Volumina anzupassen. Hier verwenden wir die Hälfte eines Standard-PCR-Volumens, das 10–12,5 μL beträgt, für den On-Chip-Nachweis von SARS-CoV-2.

Die Kanalplatte wurde in RNase Away (Thermo Fisher) eingeweicht, anschließend gründlich in nukleasefreiem Wasser gewaschen und in einer sauberen Haube an der Luft getrocknet. Als leitfähiger Film wurde ein Aluminiumklebefilm mit einer Dicke von 36 μm (Excel Scientific) verwendet und durch manuelles Aufbringen auf der Kanalplatte befestigt. Der Abstandshalter wurde durch Laserschneiden von PMMA hergestellt. Die Trägerplatte wurde unter Verwendung von Kupfermaterial bearbeitet. Das Peltier-Gerät wurde im Abstandshalter platziert und von der Trägerplatte unterstützt. Eine optionale Schicht Wärmeleitpaste (z. B. MX-4, Arctic) wurde auf die Kontaktfläche zwischen dem Chip und dem Peltier-Gerät sowie auf die Kontaktfläche zwischen dem Peltier-Gerät und dem Kühlkörper aufgetragen, um die Wärmeübertragung zu verbessern.

Das Detektionsmodul besteht aus einem Steckplatz zur Aufnahme des Chips, einer CMOS-Kamera (Arducam OV5642) und einer LED-Lichtquelle (siehe Abb. S1). Es hat Abmessungen von 110 mm × 60 mm × 90 mm und wog ca. 250 g. Die Kameraanordnung verfügt über ein großes Sichtfeld von ɸ 40 mm, das größer ist als der Probenbereich; Somit können Signale von allen Reaktionskanälen gleichzeitig erfasst werden, ohne dass die Lichtquelle und das Detektionssystem mechanisch bewegt werden müssen, wie bei anderen kommerziellen Systemen. Dadurch wird die Gesamterkennungszeit und damit die Gesamttestzeit vorteilhaft verkürzt. Das Detektionsmodul umfasst außerdem einen Filterwürfel (einschließlich eines dichroitischen Spiegels, eines Anregungsfilters und eines Emissionsfilters). Das Gehäuse des Detektormoduls wird im 3D-Druckverfahren mit vorgesehenen Steckplätzen für LEDs, Filterwürfel, Chip und Kamera aus Polymilchsäure hergestellt. Für das FAM-Signal wurden LED-Licht mit einer Spitzenwellenlänge von 492 nm, ein Anregungsfilter (446–486 nm) und ein Emissionsfilter (Grenzwert bei 520 nm) verwendet. Für direkte RT-PCR-Tests wurden zwei zusätzliche Detektionsmodule zur Erkennung des HEX-Signals (Anregungspeak bei 538 nm, Emissionspeak bei 555 nm) und des Texas Red-Signals (Anregungspeak bei 596 nm, Emissionspeak bei 613 nm) hergestellt.

Wir haben für Epidax® eine begleitende Verarbeitungs- und Analysesoftware entwickelt, um die vom Erkennungsmodul aufgenommenen Bilder für die Echtzeit- oder Endpunkterkennung zu verarbeiten. Das hauseigene Paket kann als Daemon für RT-qPCR-Experimente (für bestätigenden SARS-CoV-2-Test) ausgeführt werden. Wenn am Ende jedes Zyklus neue Bilder aufgenommen werden, durchlaufen sie das Verfahren in Abb. S2a, um das Amplifikationsdiagramm zu erstellen und den Ct-Wert zu bestimmen. Die Möglichkeit, diese Messwerte nahezu in Echtzeit zu erhalten, ist bei der POC-Diagnostik wichtig, da sie die Flexibilität bietet, die Zeit von der Probe bis zum Ergebnis zu verkürzen. Es kann beispielsweise ein klinischer Bedarf bestehen, die Ct-Werte mit dem Vorhandensein eines infektiösen Virus zu korrelieren (d. h. bei einem Ct-Wert von 20), und höhere Ct-Werte können auf eine längere Ausscheidung viraler RNA durch eine nicht infektiöse Person hinweisen30. Wenn das Testszenario nur bei infektiösen Patienten eine positive Diagnose erfordert, kann der Testlauf so programmiert werden, dass er stoppt, wenn der Erkennungsschwellenwert vor Zyklus 20 oder bei einem vorgegebenen höheren Ct-Wert erreicht wird. Dadurch wird die Erkennungseffizienz erheblich verbessert.

Dieses Analysepaket kann auch als Webanwendung für die Endpunkt-RT-PCR (für das COVID-19-Screening) ausgeführt werden, um ein schnelles Screening auf SARS-CoV-2 zu ermöglichen, wenn die Dynamik der Amplifikation nicht von Interesse ist. In diesem Modus wird ein Bild vor einer Amplifikationsreaktion (Zyklus 0) erhalten und mit einem Bild nach mehreren Amplifikationszyklen (z. B. Zyklus 45) verglichen. Der Intensitätsunterschied zwischen diesen Bildern (nach der Verarbeitung wie in Abb. S2e dargestellt) kann verwendet werden, um den Schluss zu ziehen, dass die Probe positiv für SARS-CoV-2 ist, wenn sie über einem Screening-Schwellenwert liegt, andernfalls negativ.

Abbildung 2a zeigt verschiedene SARS-CoV-2-Nachweismethoden mit Epidax®, einschließlich (a) Echtzeit-RT-qPCR-Analyse für den SARS-CoV-2-Bestätigungstest; (b) Endpunkt-RT-PCR; und (c) RT-LAMP zum Screening. Bei jeder Anwendung wurden Experimente mit dem Epidax®-System durchgeführt und mit kommerziellen PCR-Systemen (d. h. dem Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler und dem CFX96 qPCR-Detektionssystem von Bio-Rad, in diesem Dokument als „Bio-Rad“ bezeichnet) verglichen und das ProFlex PCR-System von Applied Biosystems, in diesem Dokument als „ProFlex“ bezeichnet).

eine Demonstration verschiedener Anwendungen mit Epidax®, einschließlich: SARS-CoV-2-Bestätigungstest mit RT-qPCR und Screening mit Endpunkt-RT-PCR und RT-LAMP; b Layout für RT-qPCR und Endpunkt-RT-PCR-Test unter Verwendung eines 4-Kanal-Chips mit Singleplex-RT-PCR-Reagenz und RNA-Extraktprobe; und Interpretation der Testergebnisse. Für jeden Chip wurde eine Probe mit FAM als Fluoreszenzsonde getestet. Kanäle 1 und 2 für NC bzw. PC; Kanal 3 für das N1-Gen von SARS-CoV-2; und Kanal 4 für das menschliche RP-Gen (IC). Die grüne Farbe steht für eine positive Erkennung, während die graue Farbe für eine negative Erkennung steht. c Layout für direkte RT-qPCR- und Endpunkt-RT-PCR-Tests unter Verwendung eines 4-Kanal-Chips mit Multiplex-Direkt-RT-PCR-Reagenz und Nasopharynxprobe in UTM. In jedem Chip wurden zwei Proben (in den Kanälen 2 und 3) getestet (was die Fähigkeit von Epidax® zeigt, mehrere Proben zu testen); Kanäle 1 und 4 für NC und PC. Für jeden Kanal wurden drei Zielgene mithilfe unterschiedlicher Fluoreszenzsonden nachgewiesen, insbesondere das E-Gen von SARS-CoV-2 (FAM), das N-Gen von SARS-CoV-2 (HEX) und RNase P (Texas Red). Grau stellt ein negatives Signal dar und andere Farben (Grün, Hellgrün und Rot) stellen ein positives Signal dar; d Layout für RT-LAMP mit 6-Kanal-Chip mit RNA-Extrakt; und Interpretation der Ergebnisse. Für jeden Chip wurden zwei Proben getestet. Kanäle 1 und 2 für NC bzw. PC. Die Kanäle 3, 4, 5 und 6 testeten das N-Gen von SARS-CoV-2 bzw. das menschliche rActin-Gen (IC) von zwei verschiedenen Proben. Die gelbe Farbe weist auf eine positive Erkennung hin, die rosa Farbe auf eine negative Reaktion.

Nasopharyngeale Abstriche wurden zunächst von Patienten für den klinischen Gebrauch gesammelt und von örtlichen Krankenhäusern (National University Hospital und Ng Teng Fong General Hospital, Singapur) getestet; Dieses Testergebnis wird in diesem Dokument als „Referenzstandard“ bezeichnet. Die übrig gebliebenen Proben wurden gemäß den nationalen Biosicherheitsrichtlinien hitzeinaktiviert und dann zur Prüfung mit Epidax® an unser Labor geschickt. Die Verwendung klinischer Proben wurde vom Domain Specific Review Board (DSRB 2020/00581 und 2020/00106) und dem National University of Singapore Institutional Review Board (NUS-IRB-2020–666) genehmigt. Alle negativen Proben in UTM wurden auf der Cobas 6800-Plattform, einer Sample-to-Result-Plattform, negativ getestet. Alle positiven Proben (POS01 bis POS28) wurden in UTM gesammelt und dann wurde virale RNA mithilfe der viralen DNA- und RNA-Extraktion von abGenix auf einem viralen DNA- und RNA-Extraktionssystem von abGenix (AITbiotect) extrahiert, gefolgt von RT-qPCR auf einem Bio-Rad System. Die verbleibenden negativen und positiven Proben im UTM wurden von den entsprechenden Krankenhäusern 30 Minuten lang bei 60 °C bzw. 30 Minuten lang bei 70 °C hitzeinaktiviert, bevor sie in unser Labor überführt wurden. Für unsere Tests zu Epidax® wurde zunächst virale RNA aus diesen inaktivierten UTM-Restproben mit Qiagen QIAamp® Viral RNA Mini (Kat.-Nr. 52906) gemäß dem Spin-Protokoll des Herstellers extrahiert. Die gereinigten RNA-Proben wurden in Aliquots in Einwegröhrchen aufgeteilt und in einem Gefrierschrank bei -80 °C gelagert, um weitere Tests entweder mit RT-PCR-Reagenzien oder RT-LAMP-Reagenzien durchzuführen.

Zwanzig der an uns übertragenen klinischen Proben (RNA67 bis RNA86) waren positive RNA-Extrakte, die mit der Qiagen EZ1 Advanced-Plattform extrahiert und anschließend einer RT-qPCR unterzogen wurden, um zu bestätigen, dass sie positiv für SARS-CoV-2 waren. Der vom örtlichen Krankenhaus verwendete Ct-Grenzwert lag bei 37. Diese verbleibenden positiven RNA-Extrakte wurden vor der Übertragung in unser Labor nicht hitzeinaktiviert. Sie wurden in einem Gefrierschrank bei −80 °C gelagert.

Je nach Anwendung wurde dem RNA-Extrakt oder der UTM-Probe entweder RT-PCR, direkte RT-PCR oder RT-LAMP-Reagenz zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann mithilfe einer Öl-Sandwich-Methode auf den Mikrofluidik-Chip geladen (siehe Abb. S3) und der Chip wurde dann zur Nukleinsäureamplifikation auf dem System montiert.

Bei allen RT-PCR-Tests mit synthetischer RNA oder klinischem RNA-Extrakt wurde die Endpunkt- oder Echtzeitüberwachung der Fluoreszenzemission während der Amplifikation auf einem 4-Kanal-Chip durchgeführt (siehe Abb. 1e). Wie in Abb. 2b gezeigt, testete jeder Chip eine Probe (N1-Gen von SARS-CoV-2) und drei Kontrollen, eine Negativkontrolle (NC), eine Positivkontrolle (PC) und eine interne Kontrolle (IC – die menschliche RNase P). Gen). FAM wurde als Fluoreszenzsonde verwendet; Grün stellt eine Probe mit Fluoreszenz dar (positiver Nachweis), während Grau eine geringe oder keine Fluoreszenz anzeigt (negativer Nachweis). Gleichzeitig wurde ein separater Satz Reaktionsmischungen vorbereitet und für Benchmarking-Tests auf das Bio-Rad-System geladen. Am Ende der Reaktion wurden die Gemische aus dem Bio-Rad-System sofort auf einen sauberen, leeren Chip geladen, um sie mit dem Epidax®-Detektionsmodul mithilfe der Öl-Sandwich-Methode nachzuweisen. Beachten Sie, dass für jedes Experiment zunächst ein Bild des leeren Chips aufgenommen wurde und keine Fluoreszenz festgestellt wurde.

Es wurde ein im Handel erhältliches einstufiges RT-PCR-Reagenz (TaqPath™ 1-Step RT-qPCR Master Mix, Thermo Fisher Scientific) verwendet. Das Protokoll des Bio-Rad-Systems umfasst das Erhitzen der Probe auf 50 °C und Halten für 15 Minuten, 92 °C für 2 Minuten, gefolgt von 45 Zyklen mit 92 °C für 3 Sekunden und 55 °C für 30 Sekunden. Bei Epidax® wurde unter Berücksichtigung der Genauigkeit des Temperatursensors ein leicht modifiziertes Protokoll verwendet: Erhitzen der Probe auf 51 °C für 15 Minuten und dann auf 92 °C für 2 Minuten, gefolgt von 45 Zyklen mit 92 °C für 5 Sekunden und 56 °C für 30 s (siehe Abb. S4a). Es wurden Primer für N1- und humane RNase P-Gene mit einer FAM-Sonde (2019-nCov CDC EUA Kit, Produktcode 10006770 von IDT) verwendet (Sequenzen siehe Tabelle S1). NC steht für nukleasefreies Wasser (HyPure™ Molecular Biology Grade Water, Nuclease free, HyClone™), während PC für die 2019-nCoV N-Positivkontrolle mit 10.000 Kopien pro μL steht (IDT, Produktcode 1000 6625). Die 10-µL-Reaktionsmischung enthielt 0,75 µL Primer und Sonde, 2,5 µL RT-PCR-Mastermix, 4,25 µL nukleasefreies Wasser und 2,5 µL RNA-Matrize (siehe Tabelle S2).

Für die Multiplex-Direkt-RT-PCR mit nasopharyngealen Proben (Abb. 2c) wurden zwei Proben auf jedem 4-Kanal-Chip getestet, was die Fähigkeit zum Testen mehrerer Proben mit unserer Plattform demonstriert. Für jeden Kanal wurden drei Zielgene durch drei Fluoreszenzsonden nachgewiesen, nämlich das E-Gen (FAM), das N-Gen (HEX) und RNase P (Texas Red). Der Benchmarking-Test wurde auf einem Bio-Rad-System durchgeführt. Das verwendete kommerzielle direkte RT-PCR-Reagenz war Resolute 2.0 (Advanced MedTech Holdings). Das Temperaturprofil auf dem Bio-Rad-System umfasste das Erhitzen der Probe auf 55 °C und Halten für 15 Minuten, dann 92 °C für 2 Minuten, gefolgt von 45 Zyklen mit 92 °C für 3 Sekunden und 62 °C für 30 Sekunden. Das Protokoll für Epidax® bestand darin, die Probe auf 56 °C zu erhitzen und 15 Minuten lang zu halten, dann 2 Minuten lang auf 92 °C, gefolgt von 45 Zyklen mit 92 °C für 5 Sekunden und 63 °C für 30 Sekunden. Die Reaktionsmischung enthielt 9,65 µL Reaktionsmischung, 0,35 µL Enzymmischung und 2,5 µL Probe (siehe Tabelle S3). Das Gesamtreaktionsvolumen betrug 12,5 µL.

Für alle RT-LAMP-Tests wurde ein Sechskanal-Chip (siehe Abb. 1f) verwendet, um zwei Proben pro Chip zu testen. Es wurde kein Fluoreszenzfarbstoff zugesetzt und die Farbänderung des Reaktionsgemisches konnte mit bloßem Auge erkannt werden. Die Kanäle 1 und 2 waren jeweils für NC und PC bestimmt. Die Kanäle 3, 4, 5 und 6 testeten das N-Gen von SARS-CoV-2 und das menschliche rActin-Gen (IC) von zwei verschiedenen Proben. Wie in Abb. 2d dargestellt, zeigt Gelb einen positiven Nachweis und Rosa einen negativen Nachweis an. Der Benchmarking-Test wurde auf einem Proflex-System durchgeführt.

Eine 10-fache Primermischung wurde gemäß Zhang et al.31 hergestellt: 16 µM Vorwärts-Innenprimer (FIP) und Rückwärts-Innenprimer (BIP) (jeweils), 2 µM F3- und B3-Primer (jeweils) und 4 µM Vorwärtsschleife ( LF) und Rückwärtsschleifen-Primer (LB) (jeweils). RT-LAMP wurde mit Primern für Gene NA und rActin durchgeführt, wie in Tabelle S432 gezeigt, LAMP-Mastermix (WarmStart Colorimetric Lamp 2x Master Mix, NEB, #M1800L), nukleasefreiem Wasser (HyPure™ Molecular Biology Grade Water, Nuclease free, HyClone™) und eine 2019-nCoV N-Positivkontrolle mit 10.000 Kopien pro μL (IDT, Produktcode 1000 6625, Stammkonzentration 200.000 Kopien pro μL). Die Reaktionsmischung enthielt 2 µL 10x Primer-Mix, 10 µL LAMP-Master-Mix, 5 µL nukleasefreies Wasser und 3 µL RNA-Template (siehe Tabelle S5). Die Reaktion wurde 30 Minuten lang bei 65 °C sowohl auf Epidax®- (siehe Abb. S4b) als auch auf Proflex-Systemen durchgeführt.

Zehnfache Reihenverdünnungen der ultraniedrigen synthetischen RNA-Kontrolle (AcroMetrix™ COVID-19-Positivkontrolle, Kat.-Nr. 954519, Thermo Fisher Scientific, Stammkonzentration von 100 Kopien pro μL, quantifiziert mit Bio-Rad Droplet Digital™ PCR) wurden zunächst in nukleasefreiem Wasser hergestellt um Konzentrationen von 100, 10 und 1 RNA-Kopien pro μL zu erhalten. Anschließend wurden 2,5 µL RNA-Probe in jeder Konzentration mit 7,5 µL PCR-Mastermix und N1-Primer für ein Reaktionsvolumen von 10 µL gemischt (Einzelheiten finden Sie im Unterabschnitt Testlayout zum Nachweis von SARS-CoV-2). 45 PCR-Zyklen wurden sowohl auf dem Epidax®- als auch dem Bio-Rad-System durchgeführt. Echtzeit-Fluoreszenzbilder am Ende jedes Zyklus für alle Konzentrationen (100, 10, 1 und 0 RNA-Kopien pro μL) werden in Film S1 gezeigt. Die Experimente wurden fünfmal wiederholt, um die Reproduzierbarkeit des Systems zu zeigen. Abbildung 3a, b vergleichen die Ct-Werte für jede Konzentration, die von Epidax® und Bio-Rad erhalten wurden. Abbildung 3 c, d zeigt Amplifikationsdiagramme eines von Epidax® bzw. Bio-Rad verarbeiteten Laufs, während Abb. 3e die Fluoreszenzbilder der Proben nach 45 Zyklen vergleicht. Sowohl auf Epidax®- als auch auf Bio-Rad-Systemen führten 4 von 5 Replikaten zu einer Amplifikation von 1 Kopie pro µL synthetischer SARS-CoV-2-RNA. Dies zeigt, dass Epidax® bei der Amplifikation von 1 RNA-Kopie pro µL eine ebenso gute Leistung wie Bio-Rad erbringt. Die Nachweisgrenze (LOD) dieses Assays, bei dem sowohl Epidax®- als auch Bio-Rad-Systeme für qPCR und Endpunkt-PCR verwendet wurden, betrug 10 Kopien pro μL (oder 25 Kopien pro Reaktion bei einem Reaktionsvolumen von 10 μL), wie alle 5 Replikate zeigten positive Verstärkung. LOD ist hier definiert als die niedrigste nachweisbare Konzentration, wobei 95 % der Proben (richtig positiv) einen positiven Nachweis zeigen.

a RT-PCR Ct-Werte, die mit Epidax® verarbeitet wurden. b RT-PCR-Ct-Werte, die mit dem Bio-Rad-System verarbeitet wurden. c Amplifikationsdiagramm eines Laufs mit Epidax®. d Amplifikationsdiagramm eines Laufs mit dem Bio-Rad-System. e Fluoreszenzbilder der Proben nach 45 PCR-Zyklen (Zyklus 45) auf Epidax®- und Bio-Rad-Systemen; f Kolorimetrische Bilder der Proben nach RT-LAMP-Reaktion auf Epidax®- und Proflex-Systemen.

In RT-LAMP-Analysetests wurden zweifache Reihenverdünnungen synthetischer RNA, die das Gen N von SARS-CoV-2 (VR-3276SD, ATCC) trägt, in nukleasefreiem Wasser hergestellt, um Konzentrationen von 800, 400, 200, 100 zu erreichen und 50 RNA-Kopien pro μL. Anschließend wurden 3 µL RNA-Probe in jeder Konzentration mit 17 µL RT-LAMP-Mastermix und Primern für eine 20 µL-Reaktion gemischt (Einzelheiten finden Sie im Unterabschnitt Testlayout zum Nachweis von SARS-CoV-2). Die isotherme Amplifikation wurde auf Epidax®- und Proflex-Systemen 30 Minuten lang bei 65 °C durchgeführt. Die Experimente wurden fünfmal wiederholt, um die Reproduzierbarkeit des Systems zu zeigen. Wie in den Abb. gezeigt. 3f, 4 von 5 Replikaten ergaben eine Amplifikation (d. h. gelbe Farbe) für 100 Kopien pro μL synthetischer SARS-CoV-2-RNA auf beiden Systemen. Der LOD dieses RT-LAMP-Assays betrug 200 Kopien pro μL. Dies zeigt, dass Epidax® genauso gut ist wie Proflex.

a Ct-Werte von 23 mit Epidax® nachgewiesenen positiven Proben; b Ct-Werte von 23 von Bio-Rad nachgewiesenen positiven Proben; c Ct-Werte von 20 mit Epidax® nachgewiesenen negativen Proben; d Ct-Werte von 20 von Bio-Rad nachgewiesenen negativen Proben. Nicht erkannte Ct-Werte werden zur Visualisierung als 46 dargestellt. Die gestrichelte Linie stellt die Cutoff-Linie (Ct-Wert von 37) dar, die von örtlichen Krankenhäusern verwendet wird, dh ein Ct-Wert unter 37 wird als positive Probe betrachtet, andernfalls als negativ. Alle Kontrollen einschließlich NC, PC und IC aller Proben verliefen wie erwartet.

Informationen zum analytischen Spezifitätstest finden Sie in Anhang B, Tabellen S6–S8 in den Zusatzinformationen.

In diesem Abschnitt haben wir die Verwendung von Epidax® zum SARS-CoV-2-Nachweis mit RT-qPCR für 43 klinische Proben (23 bekannt positive und 20 bekannt negative) demonstriert. Für jede klinische Probe wurden 2,5 μl gereinigter RNA-Extrakt mit 7,5 μl Singleplex-RT-PCR-Mastermix gemischt (siehe Unterabschnitt Testlayout zum Nachweis von SARS-CoV-2 zur Vorbereitung des Reaktionsmixes). Es wurden 45 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Kanal mit 10 μl des Reaktionsgemisches beladen war (siehe Abb. 2b für den Testaufbau und die Ergebnisinterpretation).

Echtzeit-Fluoreszenzbilder am Ende jedes Zyklus wurden mit unserem System erfasst und analysiert (siehe Filme S2 und S3 für eine negative bzw. eine positive Probe). Die Ct-Werte aller drei Kontrollen und Proben, die mit Epidax® verarbeitet wurden, waren denen ähnlich, die mit dem Bio-Rad-System verarbeitet wurden (siehe Abb. 4 – Ct-Werte, die nicht erkannt wurden, sind zur Visualisierung als 46 dargestellt).

Die Anwendung eines Cutoff-Ct-Werts von 37, der von örtlichen Krankenhäusern verwendet wurde, zeigte, dass alle Kontrollen wie erwartet funktionierten. Unter den Proben (Kanal 3) wurden alle bekannten positiven und bekannten negativen Proben sowohl mit dem Epidax®- als auch dem Bio-Rad-System korrekt identifiziert und zeigten einen Ct-Bereich von 14,7 bis 37 für positive Proben (Abb. 4a, b); und 46 (dh nicht erkannt) für negative Proben (siehe Abb. 4c, d). Daher berichten wir über eine vergleichbare Leistung von Epidax® mit dem Bio-Rad-System in einem SARS-CoV-2-Bestätigungstest unter Verwendung des RT-qPCR-Wegs.

Wir führten einen Endpunkt-RT-PCR-Test mit Epidax® an 81 klinischen Proben durch (40 SARS-CoV-2-Positive und 41 bekanntermaßen Negative). Hier wurde das Detektionsmodul nur angebracht, um Fluoreszenzbilder des Chips bei Zyklus 0 (vor der Reaktion) und Zyklus 45 (am Ende des Temperaturzyklus – siehe Abb. S5) aufzunehmen. Das SARS-CoV-2-Screening erfolgte mittels Intensitätsschwellenwert, bei dem eine Probe als positiv galt, wenn die relative Intensität über dem Screening-Schwellenwert von 10 lag, andernfalls als negativ. Alle 40 bekannten positiven Proben und 41 bekannten negativen Proben wurden sowohl vom Epidax®- als auch vom Bio-Rad-System korrekt als positiv bzw. negativ identifiziert (Abb. 5). Somit lagen die Sensitivität und Spezifität unseres Tests für SARS-CoV-2 bei 100 %, mit falsch-negativen und falsch-positiven Raten von 0 %. Die Sensitivität wird hier als wahr-positive Ergebnisse/(wahr-positive Ergebnisse + falsch-negative Ergebnisse) definiert, und die Spezifität wird als wahr-negative Ergebnisse/(wahr-negative Ergebnisse + falsch-positive Ergebnisse) definiert33. In Abb. S6 sind die relativen Intensitäten, die für jeden Kanal separat erhalten wurden, grafisch dargestellt. Es ist klar, dass die von Epidax® erhaltenen Signale mit denen von Bio-Rad vergleichbar sind.

a Von Epidax® erkannt; b Erhalten durch Ausführen von 45 PCR-Zyklen auf dem Bio-Rad-System, dann wurden die Proben auf einen leeren Chip geladen und die Fluoreszenzbilder mit dem Epidax®-Detektionsmodul aufgenommen und die Bilder auf ähnliche Weise wie die von Epidax® analysiert. Unter Verwendung desselben Schwellenwerts der relativen Intensität 10 (gestrichelte Linie) wurden 40 positive Proben (mit relativen Intensitäten im Bereich von 20–42) und 41 negative Proben (alle mit relativen Intensitäten unter 10) genau erkannt. Alle Kontrollen funktionierten wie erwartet: Alle NCs hatten relative Intensitäten unter 10, während alle PCs und ICs relative Intensitäten über 10 hatten (im Bereich von 20 bis 44).

Im Allgemeinen ist Epidax® zum Zweck des COVID-19-Screenings bei Patienten genauso gut wie Bio–Rad.

Um die Dauer des Endpunkt-RT-PCR-Tests zu untersuchen, wurden die Fluoreszenzintensitäten von 23 positiven Proben und 20 negativen Proben (verwendet im RT-qPCR-Test in Abb. 4) am Ende der Zyklen 37, 40 und 45 gemessen. Abb. S7 zeigt die relativen Intensitäten von drei Kontrollen und Proben in den Zyklen 37, 40 und 45. Für den Endpunkt-RT-PCR-Test würden wir mindestens 40 PCR-Amplifikationszyklen benötigen. Am Ende von Zyklus 37 lagen die Intensitäten einiger positiver Proben und ICs immer noch unter der Screening-Schwelle. Am Ende von Zyklus 40 gab es nur ein falsch negatives Ergebnis und die anderen 42 Proben wurden alle korrekt identifiziert. Die beste Leistung wurde bei Zyklus 45 erzielt, wo alle Proben korrekt als positiv und negativ identifiziert wurden.

Mit direkten RT-PCR-Protokollen, bei denen keine RNA-Extraktion erforderlich ist, könnten erhebliche Zeit- und Kosteneinsparungen erzielt werden. Hier demonstrieren wir den schnellen Proben-zu-Antwort-Nachweis von SARS-CoV-2 mithilfe unserer Plattform mit einem Multiplex-Direkt-RT-PCR-Kit an Nasopharynx-Abstrichproben (siehe Abb. 2c für das Testlayout und den Unterabschnitt Testlayout für den Nachweis von SARS-CoV-2). CoV-2 für die Reaktionsmischungsvorbereitung). Wir führten sowohl Endpunkt- als auch direkte Echtzeit-RT-PCR-Tests an 44 klinischen Proben in UTM durch (24 bekanntermaßen positive und 20 bekanntermaßen negative). Auf jedem Chip wurden zwei Proben getestet, und die Testdauer von der Probe bis zum Ergebnis betrug etwa eine Stunde.

Beim SARS-CoV-2-Screening identifizierte unsere Plattform 23/24 positive Proben und 19/20 negative Proben korrekt, während Bio-Rad 24/24 positive und 17/20 negative Proben genau erkannte (ausführliche Ergebnisse finden Sie in Abb. S8 und Tabelle S9). ). Die Proben, die nicht korrekt identifiziert wurden, hatten Ct-Werte von ~37, was dem von den örtlichen Krankenhäusern verwendeten Grenzwert entspricht.

Für die Echtzeiterkennung haben wir nur Fluoreszenzbilder (zur Bestimmung des Ct-Werts) vom N-Gen von SARS-CoV-2 (HEX) gesammelt, wie in Tabelle S10 gezeigt. Unser System erkannte 23/24 positive und 20/20 negative Proben, während Bio-Rad 24/24 positive Proben und 18/20 negative Proben erkannte.

Epidax® wurde zur Analyse von 54 klinischen RNA-Extrakten (30 bekannt positive, 24 bekannt negative) mithilfe von RT-LAMP verwendet. Die Proben mit RT-LAMP-Reagenzien und Primersätzen, die auf das N-Gen von SARS-CoV-2 abzielen, wurden auf den Chip für Epidax® und in Röhrchen für das Proflex-System geladen (Testlayout siehe Abb. 2d). In jedem Lauf wurden zwei Proben zusammen getestet (Testergebnisse siehe Abb. S9). Im Allgemeinen war die Farbänderung auf dem Chip vergleichbar mit den Ergebnissen, die mit dem Proflex-System erzielt wurden. Wir haben beobachtet, dass dieser RT-LAMP-Assay positive Proben mit RT-qPCR-Ct-Werten von bis zu 30 zuverlässig erkannte, was gut mit den Ergebnissen der Studie von Dao Thi et al.34 übereinstimmt. Bei positiven Proben mit Ct-Werten über 30 melden wir jedoch 12 von 16 Proben mit falsch negativen Ergebnissen.

Der aktuelle Goldstandard für den SARS-COV-2-Nachweis aus Nasopharyngealabstrichen basiert auf RT-qPCR, die laborbasierte Protokolle zur Virusextraktion erfordert. Die meisten kommerziellen COVID-19-Diagnosetests sind für den Laborgebrauch auf Geräten mit großem Platzbedarf und hohen Kosten gedacht und nicht auf POC-Einstellungen zugeschnitten35. Obwohl sie automatisiert sind und einen hohen Durchsatz aufweisen, eignen sie sich nicht für den Einsatz vor Ort zu Screeningzwecken. POC-Systeme erfordern oft Erschwinglichkeit, Portabilität und die Fähigkeit, in Umgebungen mit geringen Ressourcen zu funktionieren.

Hier haben wir eine modulare Plattform mit Flexibilität für mehrere Anwendungen mit einem breiten Empfindlichkeitsbereich demonstriert (siehe Tabelle 1 und Tabelle S11 für den Vergleich von POC-Geräten für den Nukleinsäurenachweis von SARS-CoV-2). Dieses POC-Gerät kann sowohl für das SARS-CoV-2-Screening als auch für Bestätigungstests verwendet werden. Unser System identifizierte 40 positive und 41 negative RNA-Extrakte mithilfe der Endpunkt-PCR (für das SARS-CoV-2-Screening) und 23 positive und 20 negative RNA-Extrakte mithilfe der Echtzeit-PCR (für den SARS-CoV-2-Bestätigungstest) genau und zeigte eine vollständige Übereinstimmung mit einer kommerziellen Plattform (Bio-Rad-System), mit 100 % Sensitivität und 100 % Spezifität. Um Zeit- und Kosteneinsparungen zu ermöglichen, die die Ausweitung der Tests unterstützten, verwendeten wir ein direktes RT-PCR-Kit ohne RNA-Extraktion, um 23 positive und 19 negative Nasopharynxproben mithilfe der Endpunkt-PCR und 23 positive und 20 negative Nasopharynxproben mithilfe von Echtzeit korrekt nachzuweisen PCR zeigt eine Spezifität von 95 % und eine Sensitivität von 96 %. Das System kann auch als kolorimetrischer RT-LAMP-Assay fungieren, identifiziert 30 positive und 24 negative RNA-Extrakte mit 100 % Spezifität und erkennt 14/14 positive Proben mit Ct-Werten unter 30 genau (beachten Sie, dass wir die Gesamtempfindlichkeit nicht berechnen). Der RT-LAMP-Assay hier aufgrund der begrenzten Streuung der Ct-Werte der verfügbaren positiven Proben – wie in Abb. 4a, b gezeigt, gibt es zwei unterschiedliche Gruppen von Ct-Werten.

Diese POC-Plattform zeigte eine LOD von 10 Kopien pro μL (oder 25 Kopien pro Reaktion bei einem Reaktionsvolumen von 10 μL) mit synthetischer RNA für RT-PCR und 200 Kopien pro μL LOD für RT-LAMP. Studien zur Viruslast von SARS-CoV-2 in klinischen Proben zeigen, dass dieser LOD den klinischen Anforderungen entspricht36,37.

Mithilfe dieser Plattform haben wir sowohl Screening- als auch Bestätigungstests für SARS-CoV-2 etabliert. RT-PCR oder RT-LAMP können bei gewünschten Temperaturprofilen durchgeführt werden und das Signal kann entweder durch ein Fluoreszenzsignal oder einen Farbwechsel nachgewiesen werden. Wie gezeigt, verfügt das System über eine hohe Konfigurierbarkeit, die es ihm ermöglicht, eine Vielzahl von Nukleinsäureamplifikationsprotokollen (RT-PCR, RT-LAMP usw.) auf verschiedenen Arten von Proben (RNA-Extrakte, Nasopharyngealabstriche in UTM usw.) auszuführen. Es kann auch erweitert werden, um andere Protokolle (wie Rekombinase-Polymerase-Amplifikation und direktes RT-LAMP34,38,39,40,41) auf andere Arten von Proben, wie Speichel42,43,44, mit minimalen Änderungen am Chipdesign auszuführen .

Um den Testdurchsatz zu erhöhen, kann der Chip um mehr Mikrokanäle erweitert werden, um zusätzliche Proben gleichzeitig zu verarbeiten. Die Verarbeitungszeit von der Probe bis zur Antwort auf unserem System beträgt für die direkte RT-PCR eine Stunde und könnte durch Optimierung des PCR-Protokolls weiter verkürzt werden. Unser System ist kompakt und kann in einer POC-Umgebung an Einreisehäfen, Feld- oder Gemeindekliniken, Schulen, Pflegeheimen, Arbeitsplätzen usw. eingesetzt werden. Darüber hinaus können die Wärmeeinheit und das Erkennungsmodul eine Skalierung der Tests ermöglichen. Beispielsweise können wir mehrere Endpunkt-RT-PCR- oder RT-LAMP-Tests parallel durchführen und die Ergebnisauslesung kann mithilfe des Detektionsmoduls erfolgen. Dieses Erkennungsmodul kann problemlos als eigenständige Einheit für die bildbasierte Erkennung und Analyse fungieren. Dies steht im Gegensatz zum herkömmlichen Labor-qPCR-System, das über integrierte Wärme- und Detektionseinheiten verfügt und als einzelne Einheit betrieben werden muss.

Zusammengenommen bietet das System eine modulare, kostengünstige, kompakte und tragbare Erkennungsplattform für die Point-of-Care-Diagnostik sowohl im klinischen als auch im Feldbereich. Diese Diagnoseplattform bietet eine Reihe von Funktionen, die die Einschränkungen und die Komplexität einer laborbasierten Einrichtung reduzieren und einen größeren Erfolg bei der Entwicklung einer effektiveren Teststrategie für die Gemeinschaft gewährleisten.

Carter, LJ et al. Testtechniken und Testentwicklung für die COVID-19-Diagnose. ACS Cent. Wissenschaft. 6, 591–605 (2020).

Artikel Google Scholar

Vandenberg, O., Martiny, D., Rochas, O., van Belkum, A. & Kozlakidis, Z. Überlegungen zu diagnostischen COVID-19-Tests. Nat. Rev. Mikrobiol. https://doi.org/10.1038/s41579-020-00461-z (2020).

Zhu, N. et al. Ein neuartiges Coronavirus von Patienten mit Lungenentzündung in China, 2019. New Engl. J. Med. 382, 727–733 (2020).

Artikel Google Scholar

Cepheid. Update zum Coronavirus (COVID-19) der US-amerikanischen Lebensmittel- und Arzneimittelbehörde: FDA erteilt erste Notfallzulassung für die Point-of-Care-Diagnostik. https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-issues-first-emergency-use-authorization-point-care-diagnostic. Zugriff am 14. November 2021. (2020).

Roche. Der cobas SARS-CoV-2-Test von Roche zum Nachweis neuartiger Coronaviren erhält die Notfallzulassung der FDA und ist in Märkten erhältlich, die das CE-Zeichen akzeptieren. https://diagnostics.roche.com/global/en/news-listing/2020/roche-receives-fda-emergency-use-authorization-for-cobas-sars-co.html. Zugriff am 14. November 2021. (2020).

GenMark. GenMark erhält von der FDA die Notfallzulassung für seinen ePlex® SARS-CoV-2-Test. https://ir.genmarkdx.com/news-releases/news-release-details/genmark-receives-fda-emergency-use-authorization-its-eplexr-sars. Zugriff am 14. November 2021. (2020).

DnaNudge. COVID Nudge: Schneller, laborfreier COVID-19-Test. https://www.dnanudge.com/en/COVID-Nudge. Zugriff am 14. November 2021. (2020).

Gibani, MM et al. Bewertung eines neuartigen, laborfreien Point-of-Care-Tests für SARS-CoV-2 (CovidNudge): eine diagnostische Genauigkeitsstudie. Lancet Microbe 1, e300–e307 (2020).

Artikel Google Scholar

Abbott. Abbott ID JETZT COVID-19. https://www.globalpointofcare.abbott/en/product-details/id-now.html. Zugriff am 14. November 2021. (2020).

FDA. In-vitro-Diagnostik-EUAs https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/vitro-diagnostics-euas#individual-molecular. Zugriff am 14. November 2021. (2020).

Zhen, W., Smith, E., Manji, R., Schron, D. & Berry, GJ Klinische Bewertung von drei Sample-to-Answer-Plattformen zum Nachweis von SARS-CoV-2. J. Clin. Mikrobiol. 58, e00783–00720 (2020).

Google Scholar

Abbott, ID NOW COVID-19-Test. 20 Minuten und trockene Nasentupfer in einer akademischen Einrichtung in New York City. J. Clin. Mikrobiol. 58, e01136–01120 (2020).

Google Scholar

Basu, A. et al. Durchführung des Abbott ID Now COVID-19-Schnelltests zur Nukleinsäureamplifikation unter Verwendung von Nasopharynxabstrichen, die in viralen Transportmedien transportiert werden, und trockener Nasenabstriche in einer akademischen Einrichtung in New York City. J. Clin. Mikrobiol. 58, e01136–01120 (2020).

Artikel Google Scholar

Zhuang, J., Yin, J., Lv, S., Wang, B. & Mu, Y. Fortschrittliches „Lab-on-a-Chip“ zur Erkennung von Viren – Aktuelle Herausforderungen und Zukunftsperspektiven. Biosens. Bioelektron. 163, 112291 (2020).

Artikel Google Scholar

Ahrberg, CD, Manz, A. & Chung, BG Polymerase-Kettenreaktion in mikrofluidischen Geräten. Lab Chip 16, 3866–3884 (2016).

Artikel Google Scholar

Lee, SH, Kim, SW, Kang, JY & Ahn, CH Ein Polymer-Labor auf einem Chip für die klinische Point-of-Care-Diagnostik auf Basis der Reversen Transkription (RT)-PCR. Lab Chip 8, 2121–2127 (2008).

Artikel Google Scholar

Schneegass, I., Brautigam, R. & Kohler, JM Miniaturisierte Durchfluss-PCR mit verschiedenen Template-Typen in einem Siliziumchip-Thermocycler. Lab Chip 1, 42–49 (2001).

Artikel Google Scholar

Hashimoto, M. et al. Schnelle PCR in einem kontinuierlichen Durchflussgerät. Lab Chip 4, 638–645 (2004).

Artikel Google Scholar

Kim, H., Dixit, S., Green, CJ & Faris, GW Nanotröpfchen-Echtzeit-PCR-System mit laserunterstützter Erwärmung. Opt. Express 17, 218–227 (2009).

Artikel Google Scholar

Ahrberg, CD, Ilic, BR, Manz, A. & Neužil, P. Handheld-Echtzeit-PCR-Gerät. Lab Chip 16, 586–592 (2016).

Artikel Google Scholar

Hui, J. et al. Multiplex-Proben-zu-Antwort-Detektion von Bakterien mithilfe eines durch eine Pipette betätigten Kapillar-Array-Kamms mit integrierter DNA-Extraktion, isothermer Amplifikation und Smartphone-Erkennung. Lab Chip 18, 2854–2864 (2018).

Artikel Google Scholar

Ganguli, A. et al. Schnelle isotherme Verstärkung und tragbares Nachweissystem für SARS-CoV-2. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 117, 22727 (2020).

Artikel Google Scholar

Sun, F. et al. Smartphone-basierter Multiplex-30-Minuten-Nukleinsäuretest auf lebende Viren aus Nasenabstrichextrakt. Lab Chip 20, 1621–1627 (2020).

Artikel Google Scholar

Xun, G., Lane, ST, Petrov, VA, Pepa, BE & Zhao, H. Ein schnelles, genaues, skalierbares und tragbares Testsystem für die COVID-19-Diagnose. Nat. Komm. 12, 2905 (2021).

Artikel Google Scholar

Nguyen, HQ, Bui, HK, Phan, VM & Seo, TS Ein auf dem Internet der Dinge basierendes Point-of-Care-Gerät für die direkte Reverse-Transkriptionsschleife-vermittelte isotherme Amplifikation zur Identifizierung von SARS-CoV-2. Biosens. Bioelektron. 195, 113655 (2022).

Artikel Google Scholar

Li, N. et al. Multiplex-Nachweis von Atemwegserregern mit einem tragbaren Analysegerät nach dem Prinzip „Rohprobe ein- und ausgeben“. Mikrosystem. Nanoeng. 7, 94 (2021).

Artikel Google Scholar

Subsoontorn, P., Lohitnavy, M. & Kongkaew, C. Die diagnostische Genauigkeit isothermer Nukleinsäure-Point-of-Care-Tests für menschliche Coronaviren: Eine systematische Überprüfung und Metaanalyse. Wissenschaft. Rep. 10, 22349 (2020).

Artikel Google Scholar

Giri, B. et al. Überprüfung der analytischen Leistung von COVID-19-Nachweismethoden. Anal. Bioanal. Chem. 413, 35–48 (2021).

Artikel Google Scholar

Lim, CT et al. Mikrofluidischer Chip und System. Patentanmeldung Nr. 10202008413X – (2020).

Gniazdowski, V. et al. Wiederholte molekulare Tests auf COVID-19: Korrelation der SARS-CoV-2-Kultur mit molekularen Tests und Zyklusschwellenwerten. Klin. Infizieren. Dis. https://doi.org/10.1093/cid/ciaa1616 (2020).

Zhang, Y. et al. Schneller molekularer Nachweis der RNA des SARS-CoV-2 (COVID-19)-Virus mittels kolorimetrischer LAMP. medRxiv https://doi.org/10.1101/2020.02.26.20028373 (2020).

Butler, DJ et al. Wirts-, Virus- und Umwelttranskriptomprofile des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2). bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.04.20.048066 (2020).

Parikh, R., Mathai, A., Parikh, S., Chandra Sekhar, G. & Thomas, R. Sensitivität, Spezifität und Vorhersagewerte verstehen und nutzen. Indian J. Ophthalmol. 56, 45–50 (2008).

Artikel Google Scholar

Dao Thi, VL et al. Ein kolorimetrischer RT-LAMP-Assay und eine LAMP-Sequenzierung zum Nachweis von SARS-CoV-2-RNA in klinischen Proben. Wissenschaft. Übers. Med. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.abc7075 (2020).

360dx. Coronavirus Test Tracker: Im Handel erhältliche COVID-19-Diagnosetests. https://www.360dx.com/coronavirus-test-tracker-launched-covid-19-tests. Zugriff am 14. November 2021. (2020).

Pujadas, E. et al. Die SARS-CoV-2-Viruslast sagt die COVID-19-Mortalität voraus. medRxiv https://doi.org/10.1101/2020.06.11.20128934 (2020).

Jones, TC et al. Eine Analyse der SARS-CoV-2-Viruslast nach Patientenalter. medRxiv https://doi.org/10.1101/2020.06.08.20125484 (2020).

Durner, J. et al. Schnelle und einfache Hochdurchsatztestung von COVID 19. Dent. Mater. 36, e141–e142 (2020).

Artikel Google Scholar

Wee, SK, Sivalingam, SP & Yap, EPH Schneller direkter Nukleinsäureamplifikationstest ohne RNA-Extraktion für SARS-CoV-2 mit einem tragbaren PCR-Thermocycler. Gene https://doi.org/10.3390/genes11060664 (2020).

Ladha, A., Joung, J., Abudayyeh, OO, Gootenberg, JS & Zhang, F. Eine 5-minütige RNA-Vorbereitungsmethode für den COVID-19-Nachweis mit RT-qPCR. withRxiv https://doi.org/10.1101/2020.05.07.20055947 (2020).

Smyrlaki, I. et al. Durch die extraktionsfreie SARS-CoV-2-RT-PCR sind umfangreiche und schnelle COVID-19-Tests möglich. Nat. Komm. 11, 4812 (2020).

Artikel Google Scholar

Ranoa, DRE et al. Speichelbasierter molekularer Test auf SARS-CoV-2, der die RNA-Extraktion umgeht. bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.06.18.159434 (2020).

Vogels, CBF et al. SalivaDirect: eine vereinfachte und flexible Plattform zur Verbesserung der SARS-CoV-2-Testkapazität. Med https://doi.org/10.1016/j.medj.2020.12.010 (2020).

Wei, S. et al. Vor Ort einsetzbarer, schneller diagnostischer Test von Speichelproben auf SARS-CoV-2. medRxiv https://doi.org/10.1101/2020.06.13.20129841 (2020).

Referenzen herunterladen

Wir danken Dr. Chun Ping Lim für seine fruchtbare Diskussion und seinen Rat zum Analysepaket. Diese Forschung wird von der National University of Singapore (NUS) mit der Förderreferenznummer NUSCOVID19RG-34 finanziert. Wir bedanken uns auch für die Unterstützung durch das Institute for Health Innovation and Technology (iHealthtech) an der NUS.

Institut für Gesundheitsinnovation und -technologie (iHealthtech), National University of Singapore, MD6, 14 Medical Drive #14-01, Singapur, 117599, Singapur

Phuong Quoc Mai Nguyen, Ming Wang, Nelisha Ann Maria, Adelicia Yongling Li, Hsih Yin Tan, Gordon Minru Xiong, Ali Asgar S. Bhagat, Catherine WM Ong und Chwee Teck Lim

Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 4 Engineering Drive 3, Block 4, #04-08, Singapur, 117583, Singapur

Phuong Quoc Mai Nguyen, Ali Asgar S. Bhagat und Chwee Teck Lim

Advanced MedTech, 2 Venture Drive, #23-18 Vision Exchange, Singapur, 608526, Singapur

Meng-Kwang Marcus Tan

Translationales Forschungsprogramm für Infektionskrankheiten, Abteilung für Medizin, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, NUHS Tower Block, 1E Kent Ridge Road Level 11, Singapur, 119228, Singapur

Catherine WM Ong

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CTL initiierte und leitete das Projekt. PQMN entwickelte das On-Chip-Temperaturmodul und entwarf und fertigte die Mikrofluidik-Chips. MW entwickelte die Hardware für das Erkennungssystem und den Code für die Echtzeit-Bilderfassung. PQMN entwickelte die Bildanalysesoftware für das Echtzeit- und Endpunkt-SARS-CoV-2-Screening und analysierte die Daten. PQMN, NAM und AYL führten Tests an synthetischen und klinischen Proben durch. HYT führte eine RNA-Extraktion an klinischen Proben durch. GMX führte eine In-silico-Analyse der Primer durch. CWMO überwachte die Entnahme klinischer Proben mit den erforderlichen ethischen und bioregulatorischen Genehmigungen. AASB und GMX nahmen an der Projektdiskussion teil. MKMT steuerte direkte RT-PCR-Reagenzien zum Nachweis von SARS-CoV-2 bei. PQMN hat das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript bearbeitet.

Korrespondenz mit Catherine WM Ong oder Chwee Teck Lim.

CTL, PQMN, MW, AYL, GMX und AASB haben zusammen mit anderen eine Patentanmeldung für die hier beschriebene Technologie eingereicht.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Nguyen, PQM, Wang, M., Ann Maria, N. et al. Modulares Mikro-PCR-System zur schnellen Diagnose von COVID-19 vor Ort. Microsyst Nanoeng 8, 82 (2022). https://doi.org/10.1038/s41378-022-00400-3

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Eingegangen: 19. Februar 2022

Überarbeitet: 17. April 2022

Angenommen: 05. Mai 2022

Veröffentlicht: 19. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41378-022-00400-3

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